番茄LeNLP4轉(zhuǎn)錄因子的功能分析.pdf

1、NAC(NAM, ATAF1/2，CUC2)轉(zhuǎn)錄因子是近十幾年來新發(fā)現(xiàn)的植物所特有的轉(zhuǎn)錄因子，構(gòu)成了最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一。NAC作為轉(zhuǎn)錄因子起激活或抑制應答的功能，主要涉及頂端分生組織的形成，次生細胞壁的形成，側(cè)根的發(fā)育，胚胎的發(fā)育，植物的衰老以及植物對生物和非生物脅迫反應等。因此，開展LeNLP4的功能研究對番茄根系發(fā)育和NAC轉(zhuǎn)錄因子的抗逆性有非常重要的作用。
　　本研究從番茄葉片中克隆到一個NAC轉(zhuǎn)錄因子LeNLP4，過表

2、達該基因促進了番茄植株根系的發(fā)育，并且提高了轉(zhuǎn)基因番茄植株的耐冷性及轉(zhuǎn)基因煙草植株的耐熱性。主要結(jié)果如下:
　　(1)通過NCBI查得該基因的全長mRNA序列，設計特異引物，利用RT-PCR的方法獲得該基因的全長cDNA。LeNLP4全長1595bp，開放閱讀框1218bp，編碼406個氨基酸，N-端具有保守的NAC結(jié)構(gòu)域，C-端為轉(zhuǎn)錄激活區(qū)。qRT-PCR結(jié)果表明，LeNLP4在根中表達量最高，其次是花和果實。同時，該基因的轉(zhuǎn)錄

3、物受低溫、高溫、鹽、干旱以及激素誘導。
　　(2)將LeNLP4∷GFP融合蛋白在洋蔥表皮細胞中瞬時表達，利用激光共聚焦顯微鏡觀察到該融合蛋白定位于細胞核中。
　　(3)構(gòu)建了原核表達載體pET-LeNLP4，用IPTG誘導其在大腸桿菌BL21中表達，將誘導的蛋白純化后免疫小鼠，制備抗體，測得效價為1∶100，000。Western雜交表明，過表達株系中LeNLP4蛋白的表達量增加。
　　(4)將LeNLP4的編碼區(qū)與

4、pBI121載體重組，成功構(gòu)建了過表達載體和反義表達載體，利用農(nóng)桿菌介導的葉盤法轉(zhuǎn)化番茄，通過PCR、qRT-PCR和Western雜交檢測具有卡那抗性的轉(zhuǎn)基因植株，結(jié)果表明獲得了過表達LeNLP4的轉(zhuǎn)基因番茄植株和反義抑制LeNLP4表達的轉(zhuǎn)基因小苗，后者影響頂端分生組織發(fā)育而死亡。與野生型(WT)相比，過表達株系根的長度增長，干重增加。
　　(5)與WT植株相比，在低溫(4℃)脅迫下轉(zhuǎn)基因番茄植株具有較高的生長量和光系統(tǒng)Ⅱ最大

5、光化學效率(PSⅡ，F(xiàn)v/Fm)，過氧化氫(H2O2)和超氧陰離子(O2·-)清除速率，抗壞血酸過氧化物酶(APX)和超氧化物歧化酶(SOD)活性，以及較低的丙二醛(MDA)含量和相對電導率(REC)。過表達株系中CBF1的表達高于WT。上述結(jié)果表明，LeNLP4轉(zhuǎn)錄因子的過表達提高了轉(zhuǎn)基因番茄抗低溫脅迫能力。
　　(6)獲得轉(zhuǎn)基因煙草，與WT植株相比，在高溫(42℃)脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草植株具有較高Fv/Fm，H2O2和O2·-清除