紫杉醇水蛭素復合物對兔血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞生長的影響.pdf

1、背景和目的:
　　 經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（percataneous coronary interventions，PCI）已經(jīng)成為狹窄性冠狀動脈疾病的標準治療方法，藥物洗脫支架（drug-eluting stent，DES）（包括紫杉醇和雷帕霉素）以其顯著的抗再狹窄作用而被廣泛地應用于冠心病的介入治療，即使對于急性心肌梗死，DES 仍可安全使用，并且可以降低支架內(nèi)再狹窄和再血管化的發(fā)生率。然而，置入DES 仍有10％-20％的再

2、狹窄率，部分DES 甚至并未降低心血管主要不良事件（major adversecardiac events，MACE）的發(fā)生率，延遲的支架血栓形成更是人們十分關注的焦點。血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）增殖和遷移引起的內(nèi)膜過度增生是導致支架內(nèi)再狹窄的關鍵因素之一。紫杉醇是一種微管抑制劑，主要抑制細胞周期的G0/G1期和G2/M 期，抑制紡錘體形成以及與細胞分裂有關的跨膜信號轉(zhuǎn)導和基因表

3、達，從而抑制所有依賴微管的細胞生理過程，包括增殖、遷移和分泌功能，毫微克分子濃度的紫杉醇即能有效抑制血管平滑肌細胞的增殖和移行。紫杉醇藥物涂層支架在抑制平滑肌細胞增生的同時也抑制了血管內(nèi)皮細胞，延遲了血管內(nèi)皮化進程，可導致亞急性和遲發(fā)性血栓形成。支架血栓形成是DES的災難性并發(fā)癥，盡管支架血栓形成的發(fā)生率較低，但其后果嚴重，死亡率較高，是PCI 最主要的死亡原因之一，如何把血栓形成的風險降至最低是目前國內(nèi)外研究抗增殖藥物的焦點和前沿領域

4、。
　　 PCI 圍術期血栓形成的機制主要包括兩個環(huán)節(jié)：凝血酶活化和血小板激活，其中凝血反應在該過程中發(fā)揮承上啟下的作用。凝血酶除了將纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白參與凝血過程外，還通過激活凝血酶受體引發(fā)直接或者間接凝血酶介導的分子和細胞間的相互作用。伴隨凝血過程的瀑布式反應，凝血酶既能使內(nèi)皮通透性增強，引發(fā)一系列血管損傷反應；凝血酶又具有生長激素樣作用，促進血管損傷后的增殖反應；同時還與血小板、蛋白激酶和粘附分子等形成復雜的網(wǎng)絡連接

5、，因而凝血酶在再狹窄過程中既起著重要的始動作用，又貫穿于全過程。水蛭素是直接凝血酶抑制劑，與肝素不同，水蛭素對凝血酶的抑制和滅活作用不依賴于抗凝血酶Ⅲ、肝素輔助因子Ⅱ、蛋白C 或組織因子途徑抑制物，且不被血小板結合而失活，有抑制凝血酶誘發(fā)的血小板聚集作用，因此具有良好的抗凝和抗血栓作用。
　　 本課題通過細胞培養(yǎng)技術體外探討紫杉醇水蛭素復合物對兔血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞生長的影響，尋找二者能夠最大限度抑制平滑肌細胞、最小限度抑制

6、內(nèi)皮細胞的合適比例，為研發(fā)紫杉醇水蛭素復合藥物支架提供理論依據(jù)。本實驗分為兩個部分：
　　 第一部分水蛭素對體外培養(yǎng)的兔血管內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞生長的影響
　　 方法:
　　 用體外培養(yǎng)兔血管內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞第3～5代，加入96孔細胞培養(yǎng)板，同時加入不同濃度的水蛭素0.78、1.56、3.13、6.25、12.50、25.00ug/ml，每6孔為一個濃度組，1640培養(yǎng)液為空白對照組，共7組，培養(yǎng)48 h后用

7、MTT 法(噻唑藍比色試驗)測定各孔貼壁細胞的吸光度A值（absorption，吸光度）。
　　 結果:
　　 與空白對照組相比，0.78～6.25 ug/ml濃度組水蛭素作用于體外培養(yǎng)的兔血管內(nèi)皮細胞后，細胞形態(tài)無明顯改變，貼壁良好，生長無明顯抑制作用（p>0.05）；12.50、25.00ug/ml濃度組水蛭素作用于體外培養(yǎng)的兔血管內(nèi)皮細胞后，細胞密度減小，生長呈現(xiàn)抑制作用（p<0.05）；水蛭素作用于兔血管平滑肌細

8、胞后，與空白對照組相比，0.78、1.56 ug/ml濃度組水蛭素對平滑肌細胞形態(tài)無明顯改變，3.13～25.00ug/ml濃度組水蛭素作用于平滑肌細胞后，細胞密度有所減小、排列松散，A值下降，呈現(xiàn)抑制平滑肌細胞的生長（p值均<0.05）。
　　 結論:
　　 0.78～6.25ug/ml水蛭素對體外培養(yǎng)兔血管內(nèi)皮細胞生長無顯著抑制作用，12.50～25.00ug/ml水蛭素可明顯抑制兔血管內(nèi)皮細胞生長；0.78～1.5

9、6 ug/ml水蛭素對體外培養(yǎng)兔血管平滑肌細胞生長無明顯抑制作用，3.13～25.00ug/ml水蛭素可抑制兔血管平滑肌細胞的生長。
　　 第二部分 紫杉醇水蛭素復合物對兔血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞生長的影響
　　 方法:
　　 用體外培養(yǎng)兔血管內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞第3～5代，加入96孔細胞培養(yǎng)板，根據(jù)加入藥物分為五組:①空白對照組：采用1640培養(yǎng)液為空白對照組；②紫杉醇對照組：1umol/L；③小劑量復合藥物組

10、（紫杉醇1umol/L+水蛭素3.13ug/ml）；④中劑量復合藥物組（紫杉醇1umol/L+水蛭素4.50ug/ml）；⑤大劑量復合藥物組（紫杉醇1umol/L+水蛭素6.25ug/ml），每6孔為一個濃度組, 共同培養(yǎng)48 h后用MTT 法(噻唑藍比色試驗)測定各孔貼壁細胞的吸光度A值（absorption，吸光度）。
　　 結果:
　　 與紫杉醇單藥組相比，紫杉醇加用小劑量水蛭素對體外培養(yǎng)兔血管內(nèi)皮細胞生長有顯著性