陳皮生物堿提取物抗肺纖維化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　 研究陳皮生物堿提取物(Citrusalkaloidextract，CAE)，對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞(MRC-5)增殖的影響；運(yùn)用博萊霉素(BLM)誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化(PF)模型，研究陳皮生物堿提取物對(duì)大鼠PF的干預(yù)治療作用，并探討其可能的作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 1．將MRC-5細(xì)胞傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞分為正常對(duì)照組、藥物實(shí)驗(yàn)組，采用四氮唑鹽比色法（MTT法）對(duì)不同濃度的

2、陳皮生物堿提取物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，同時(shí)采用乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)定法來(lái)檢測(cè)陳皮生物堿提取物的細(xì)胞毒性。
　　 2．大鼠隨機(jī)分為正常組、對(duì)照組、強(qiáng)的松組、陳皮生物堿提取物8mg/kg/day（CAE-8）組、16mg/kg/day(CAE-16)組，32mg/kg/day(CAE-32)組。各組大鼠每周稱(chēng)重，觀察其體重變化；除正常組外，其余各組均采用BLM氣管內(nèi)注入建立PF模型。建模后正常組和對(duì)照組大鼠予生理鹽水灌胃，其余各組大鼠分別給予

3、陳皮生物堿提取物溶液灌胃。各組大鼠于實(shí)驗(yàn)第28天處死，留取血清及肺組織。將肺組織行HE及Masson染色觀察肺組織病理學(xué)變化，判斷肺泡炎和肺纖維化的程度。采用堿水解法及紫外分光光度檢測(cè)法測(cè)定大鼠血清和肺組織中羥脯氨酸(HYP)的含量；分別使用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和蛋白質(zhì)印記法(Westernblotting)檢測(cè)肺組織中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)及金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1)

4、的mRNA和蛋白的表達(dá)水平，并進(jìn)行圖像定量分析。
　　 結(jié)果：
　　 1．體外實(shí)驗(yàn)：陳皮生物堿提取物在不同濃度下均表現(xiàn)為抑制MRC-5增殖的作用，并隨劑量變化呈量效關(guān)系。通過(guò)LDH法驗(yàn)證陳皮生物堿提取物對(duì)MRC-5細(xì)胞增殖的抑制作用為其藥物活性而非其毒性。
　　 2．體重變化：陳皮生物堿提取物CAE-16組在第7天、第21天、第28天以及CAE-32組在第28天時(shí)體重增幅顯著高于對(duì)照組(P＜0.01);CAE-8

5、組在第7天時(shí)體重增幅明顯高于強(qiáng)的松組(P＜0.01)。
　　 3．肺泡炎及肺纖維化積分：陳皮生物堿提取物處理組（CAE-8，16，32組）肺泡炎及肺纖維化積分均顯著低于對(duì)照組(P＜0.01或P＜0.05)。
　　 4．HYP含量測(cè)定結(jié)果：強(qiáng)的松組、陳皮生物堿提取物處理組（CAE-8，16，32組）肺組織及血清中HYP含量均低于對(duì)照組(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 5．RT-PCR及Westernblott

6、ing檢測(cè)結(jié)果：和正常組比較：對(duì)照組大鼠肺組織中MMP-9的mRNA及蛋白表達(dá)水平均下降（P＜0.05或P＜0.01），同時(shí)，TIMP-1的mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P＜0.05)，對(duì)照組肺組織中TNF-αmRNA及蛋白的表達(dá)水平均顯著升高(P＜0.05)。(1)各組藥物處理組肺組織中MMP-9mRNA表達(dá)水平和對(duì)照組比較，CAE-8組和CAE-32組均顯著升高(P＜0.05或P＜0.01)，強(qiáng)的松組和CAE-16也有所升高，但

7、無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；各組藥物處理組肺組織中TIMP-1mRNA表達(dá)水平和對(duì)照組比較：CAE-32組、強(qiáng)的松組和CAE-16組均顯著下降（P＜0.05或P＜0.01），CAE-8組也有所下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；各組藥物處理組肺組織中TNF-αmRNA表達(dá)水平和對(duì)照組比較：強(qiáng)的松組、CAE-16組及CAE-32組顯著下降(P＜0.05)，CAE-8組也有所下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2)各組藥物處理組肺組織中MMP-9蛋白表達(dá)水平和對(duì)照組比較：強(qiáng)的松組

8、、CAE-16組及CAE-32組均顯著升高(P＜0.05或P＜0.01)，CAE-8組也有所升高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；各組藥物處理組肺組織中TIMP-1蛋白表達(dá)水平和對(duì)照組比較：強(qiáng)的松組、CAE-8組、CAE-16組和CAE-32組均顯著下降(P＜0.05或P＜0.01)。各組藥物處理組肺組織中TNF-α蛋白表達(dá)水平和對(duì)照組比較：CAE-32組顯著下降(P＜0.01)，強(qiáng)的松組、CAE-8及CAE-16均有所下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。