蚯蚓提取物干預(yù)矽塵誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化研究.pdf

1、塵肺病是由于長(zhǎng)期吸入生產(chǎn)性粉塵引起的以肺組織不可逆性進(jìn)行性纖維化為主的全身性疾病。當(dāng)前塵肺病仍是我國(guó)影響面最廣泛、最嚴(yán)重的職業(yè)病。我國(guó)每年新診斷職業(yè)病中85％以上為塵肺病，塵肺病中絕大多數(shù)屬于煤工塵肺和矽肺，占?jí)m肺病的90％以上。煤工塵肺包括煤肺、矽肺和煤矽肺，其發(fā)病機(jī)制與矽肺基本相同，均與煤塵/矽塵中游離二氧化硅含量密切相關(guān)。目前大容量肺灌洗術(shù)對(duì)清除肺內(nèi)粉塵很有效，適合早期病人，但是患者不易接受，難以推廣?；颊弑容^容易接受藥物治療，但

2、針對(duì)塵肺病肺纖維化的特效藥物很少。我國(guó)已經(jīng)診斷的塵肺病人已超過(guò)70萬(wàn)，而且每年新增1.5萬(wàn)左右的新病例，這類疾病的治療是現(xiàn)階段亟待解決的問(wèn)題。
　　蚯蚓也稱地龍，為常見(jiàn)的一種陸生環(huán)節(jié)動(dòng)物，生活在土壤中。其體內(nèi)含有豐富蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)及脂肪酸。蚯蚓是我國(guó)重要的中藥材之一，最早的中藥學(xué)專著《神農(nóng)本草經(jīng)》中收載的67種動(dòng)物藥中就有蚯蚓，用于治療多種疾病。1995年國(guó)家衛(wèi)生部批準(zhǔn)了蚯蚓提取物的生產(chǎn)，在治療心腦血管疾病上得到了非常廣泛的應(yīng)用。

3、蚯蚓提取物中主要的功效性成分為蚓激酶和纖溶酶。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床觀察均證明，蚯蚓提取物有著很多藥理學(xué)功能，例如纖溶，抗凝，抗炎以及抗氧化等。理論上這些功能是能夠抑制矽塵誘導(dǎo)的肺部早期炎癥反應(yīng)及后期的纖維化，目前未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此，我們構(gòu)建矽塵誘導(dǎo)的肺纖維化動(dòng)物模型，用蚯蚓提取物早期干預(yù)和治療矽肺，通過(guò)觀察病理學(xué)、肺纖維化標(biāo)志物及μ CT等判定其干預(yù)和治療效果，為開(kāi)發(fā)有效的預(yù)防/治療矽肺肺纖維化藥物提供科學(xué)依據(jù)，也為擴(kuò)大蚯蚓提取物的治療領(lǐng)域提

4、供新的線索。
　　目的:通過(guò)建立矽塵誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型，設(shè)立蚯蚓提取物預(yù)防、早期治療和纖維化成熟期治療三種實(shí)驗(yàn)方案，來(lái)探討蚯蚓提取物是否能預(yù)防/治療矽塵誘導(dǎo)的肺纖維化，為開(kāi)發(fā)有效的預(yù)防/治療矽肺病藥物提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法:(1)設(shè)計(jì)蚯蚓提取物預(yù)防、早期治療和纖維化成熟期治療矽肺三種實(shí)驗(yàn)方案;①預(yù)防方案:小鼠隨機(jī)分為4組，對(duì)照組、矽塵組、蚯蚓提取物低劑量組和高劑量組。高、低劑量組分別腹腔給予純化蚯蚓提取物（酶活性單位分

5、別為24U/g和240U/g），每天1次，共5天。然后經(jīng)氣管一次性滴注SiO2粉塵懸液，第2天繼續(xù)腹腔給予蚯蚓提取物，對(duì)照組和矽塵組給予生理鹽水，連續(xù)給藥至不同時(shí)間終點(diǎn)（7天、14天、28天）;②纖維化早期治療方案:分組同前，另外加入吡非尼酮治療組。除對(duì)照組外，其余各組均行氣管一次性滴注SiO2粉塵懸液，對(duì)照組氣管滴注生理鹽水;第4周開(kāi)始給藥治療，治療5周觀察療效。③纖維化成熟期治療方案:分組同前，矽塵處理第5周開(kāi)始給藥治療，治療4周觀

6、察療效。(2)通過(guò)小鼠BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)、病理切片HE染色、纖維化評(píng)分以及肺臟μCT來(lái)觀察SiO2粉塵誘導(dǎo)小鼠矽肺發(fā)生發(fā)展的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程;(3)通過(guò)Masson染色、免疫組化和WB等實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)膠原纖維、α-SMA、E-cad、TGF-β1、Smad2等纖維化標(biāo)志物的動(dòng)態(tài)表達(dá)情況;應(yīng)用ICP-MS檢測(cè)小鼠血清中硅含量變化趨勢(shì)。
　　結(jié)果:
　　1蚯蚓提取物預(yù)防矽塵誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化
　　(1) BALF細(xì)胞計(jì)數(shù):BALF

7、中細(xì)胞總數(shù)、巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞數(shù)量變化趨勢(shì)基本一致，矽塵能顯著增加肺泡內(nèi)上述細(xì)胞數(shù)量，但隨著處理時(shí)間的增加細(xì)胞數(shù)呈下降趨勢(shì)，蚯蚓提取物在一定程度上能抑制矽塵導(dǎo)致的炎癥細(xì)胞滲出，其BALF中細(xì)胞數(shù)量高于對(duì)照組而低于矽塵組。矽塵處理初期，蚯蚓提取物能增加BALF中淋巴細(xì)胞的數(shù)量，以高劑量組BALF中淋巴細(xì)胞數(shù)量最多，隨時(shí)間逐漸降低，在28天淋巴細(xì)胞數(shù)量低于矽塵組，高于對(duì)照組。同樣說(shuō)明蚯蚓提取物能抑制矽塵誘導(dǎo)的肺泡內(nèi)炎癥細(xì)胞滲出。
　

8、　(2)病理切片HE染色顯示及纖維化評(píng)分:染塵后7天、14天、28天分別處理小鼠，與肺纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程較為典型的矽塵組相比，蚯蚓提取物處理組高、低劑量組變化趨勢(shì)基本一致，肺泡炎癥及肺纖維化程度均較模型組明顯減輕，干預(yù)7天組肺組織炎細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū)域較模型組明顯減少。干預(yù)14天組肺組織結(jié)構(gòu)較模型組完整，成纖維細(xì)胞增殖減輕，細(xì)胞聚集范圍減小，病變程度較同期模型組輕。干預(yù)28天組雖出現(xiàn)細(xì)胞性結(jié)節(jié)，但大小及數(shù)量均較同期模型組少。纖維化評(píng)分從量化指標(biāo)

9、上進(jìn)一步證實(shí)了蚯蚓提取物能明顯抑制矽塵誘導(dǎo)的纖維化發(fā)生發(fā)展。
　　(3)μCT:處理28天后，矽塵組小鼠充氣肺容積立體像素值明顯低于對(duì)照組，高、低劑量蚯蚓提取物治療組小鼠充氣肺容積立體像素值略高于矽塵組，尤其是低劑量組與矽塵組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示矽塵導(dǎo)致肺內(nèi)含氣量減少可部分被蚯蚓提取物抑制。
　　(4)纖維化標(biāo)志物:Masson染色顯示矽塵組膠原沉積明顯增多，高、低劑量蚯蚓提取物治療組膠原沉積較少;免疫組化結(jié)果顯示矽塵組的

10、α-SMA表達(dá)水平明顯增加，高、低劑量蚯蚓提取物處理組α-SMA表達(dá)水平明顯降低，接近對(duì)照組，而E-cad表達(dá)水平呈現(xiàn)相反的變化趨勢(shì)。纖維化信號(hào)通路(TGF-β)重要分子TGF-β1和Smad2在矽塵組表達(dá)明顯上調(diào)，而高、低劑量蚯蚓提取物處理組則明顯下調(diào)。提示蚯蚓提取物能夠抑制矽塵誘導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)的沉積、成纖維細(xì)胞的活化及上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化，其機(jī)制可能是通過(guò)影響TGF-β信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。
　　(5)血清硅含量:矽塵處理7天及14天后

11、，與對(duì)照組相比，矽塵組和高、低劑量蚯蚓提取物治療組血清硅含量均增加;至28天后，矽塵組和高、低劑量蚯蚓提取物治療組血清硅含量明顯增加，且高、低劑量蚯蚓提取物治療組血清硅含量顯著高于對(duì)照組。提示蚯蚓提取物能增加硅吸收入血，從而減少了肺內(nèi)硅的含量。
　　2蚯蚓提取物治療矽塵誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化
　　(1)纖維化早期治療效果:染塵后第4周開(kāi)始治療，對(duì)照組10只小鼠均未發(fā)生纖維化性病變，矽塵組纖維化嚴(yán)重程度評(píng)分均數(shù)為3.0，分布范圍評(píng)

12、分均數(shù)為2.3;蚯蚓提取物治療組和吡非尼酮治療組病變嚴(yán)重性及分布范圍均明顯減輕，與矽塵組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示蚯蚓提取物作為治療性用藥的效果良好。
　　(2)纖維化成熟期治療效果:染塵后第5周開(kāi)始治療，對(duì)照組5只小鼠均未發(fā)生纖維化性病變，矽塵組纖維化嚴(yán)重程度評(píng)分均數(shù)為2.8，分布范圍評(píng)分均數(shù)為2.6;蚯蚓提取物治療后病變嚴(yán)重程度與矽塵組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），僅高劑量治療組病變分布范圍明顯較少，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）

13、，提示蚯蚓提取物治療效果主要是減少了纖維化病變分布范圍。μCT分析顯示與矽塵組相比，高低劑量組肺容積立體像素值增加，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示蚯蚓提取物治療成熟期肺纖維化時(shí)，能部分增加肺容積，但幅度有限。
　　結(jié)論:(1)小鼠肺纖維化的預(yù)防模型結(jié)果提示蚯蚓提取物在矽肺的發(fā)生發(fā)展的炎癥階段及纖維化階段均發(fā)揮抑制作用，且低劑量的給藥效果優(yōu)于高劑量給藥。(2)纖維化早期治療模型綜合來(lái)看，蚯蚓提取物和吡非尼酮均能有效抑制纖維化發(fā)展，且蚯蚓提取物