BMP-9修飾的ADSCS復(fù)合攜ICA的支架修復(fù)大段骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　1.建立一種簡(jiǎn)單高效的兔脂肪干細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)、傳代方法，證實(shí)其多向、尤其是骨向分化潛能。
　　2.載hBMP-9的腺病毒（Ad-hBMP-9）轉(zhuǎn)染脂肪干細(xì)胞，為ADSCs持續(xù)、高效、穩(wěn)定表達(dá)BMP-9及后續(xù)的體內(nèi)成骨實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)。
　　3.進(jìn)一步探討ADSCs體內(nèi)成骨的效率:BMP-9修飾的同種異體脂肪干細(xì)胞復(fù)合攜淫羊藿苷支架材料(nHAC)修復(fù)兔大段橈骨缺損。
　　方法：
　　1.ADS

2、Cs的分離、培養(yǎng)及鑒定:新西蘭大白兔麻醉后在無(wú)菌條件下分離兔腹股溝皮下脂肪組織，剪碎成脂肪顆粒后采用0.1％1型膠原酶37℃恒溫條件下震蕩消化，用含10％胎牛血清(FBS)及1％雙抗（青霉素、鏈霉素）的高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基(DMEM)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)、擴(kuò)增、純化和傳代兔ADSCs，并對(duì)其細(xì)胞的形態(tài)、體外增殖能力進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，并對(duì)其經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)，對(duì)其成骨、成脂肪、成軟骨能力的分化及表面標(biāo)記抗原的表達(dá)進(jìn)行分析鑒定研究。

3、r>　　2.以腺病毒為載體，Ad-hBMP-9轉(zhuǎn)染脂肪干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn):載BMP-9的腺病毒直接感染P3代的ADSCs。相差顯微鏡及熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果、細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài);MTT法檢測(cè)Ad-hBMP-9轉(zhuǎn)染ADSCs增殖情況，繪制ADSCs生長(zhǎng)曲線;RT-PCR檢測(cè)目的基因BMP-9 mRNA的表達(dá);堿性磷酸酶染色檢測(cè)ADSCs的成骨情況。
　　3.建立兔橈骨15mm缺損模型，實(shí)驗(yàn)分成7組，每組各8只，共56只。按照分組:A組:AD

4、SCs+支架+BMP-9+淫羊藿苷;B組:ADSCs+支架+BMP-9;C組:ADSCs+支架+淫羊藿苷;D組:ADSCs+支架;E組:支架+淫羊藿苷;F組:支架;G組:空白對(duì)照（注:BMP-9是轉(zhuǎn)染至ADSCs內(nèi)持續(xù)表達(dá)起作用的）。分別于術(shù)后30天、60天、90天、109天在兔麻醉下行實(shí)驗(yàn)橈骨的X線檢測(cè)、并根據(jù)Lane-Sandhu X線評(píng)分法進(jìn)行x線片評(píng)分。于術(shù)后第60天、109天分兩批處死實(shí)驗(yàn)兔，取出橈骨行缺損處骨修復(fù)情況的大體觀

5、察、生物力學(xué)測(cè)定以及組織學(xué)觀察、并利用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)對(duì)組織學(xué)切片行半定量檢測(cè)分析分析骨缺損處成骨面積比例，探討體內(nèi)成骨的效率。
　　結(jié)果：
　　1.ADSCs的分離、培養(yǎng)、分化及鑒定:通過(guò)膠原酶消化+貼壁培養(yǎng)法，體外成功地從脂肪組織中分離、培養(yǎng)出大量的成纖維細(xì)胞樣外觀的兔脂肪干細(xì)胞(ADSCs)，具有良好的細(xì)胞形態(tài)（呈梭形或多角狀，類似成纖維細(xì)胞，團(tuán)簇狀生長(zhǎng)）和極強(qiáng)的增殖能力。經(jīng)體外培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化，ADSCs具有成骨、成

6、軟骨及成脂分化潛能。兔第三代ADSCs表面標(biāo)記CD34、CD105陽(yáng)性，Sca-1高表達(dá)，不表達(dá)CD45及SSEA-1，具有干細(xì)胞的表面分子的特征。
　　2.BMP-9轉(zhuǎn)染ADSCs的實(shí)驗(yàn):(1)載BMP-9基因的腺病毒可成功轉(zhuǎn)染ADSCs。(2)熒光顯微鏡觀察，病毒感染的ADSCs，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)都顯示綠色熒光，各細(xì)胞熒光強(qiáng)弱不等。轉(zhuǎn)染后24 h已經(jīng)有較多量的綠色熒光出現(xiàn)。根據(jù)轉(zhuǎn)染后24小時(shí)的EGFP表達(dá)率統(tǒng)計(jì)Ad-hBMP9轉(zhuǎn)

7、染ADSCs的轉(zhuǎn)染效率為30.6±4.2％。48～72 h，熒光明顯增多、增強(qiáng)。7d后，轉(zhuǎn)染率高達(dá)80％以上，細(xì)胞呈團(tuán)聚狀生長(zhǎng)，細(xì)胞體積增大，部分細(xì)胞形態(tài)呈橢圓形。未感染病毒的ADSCs熒光顯微鏡下無(wú)綠色熒光出現(xiàn)。(3) Ad-hBMP9轉(zhuǎn)染ADSCs后的生長(zhǎng)曲線與正常培養(yǎng)的ADSCs的生長(zhǎng)曲線基本一致。(4)RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)hBMP-9的mRNA持續(xù)陽(yáng)性表達(dá)，未轉(zhuǎn)染組未見(jiàn)陽(yáng)性條帶。(5)ADSCs轉(zhuǎn)染后，ALP

8、染色為陽(yáng)性，轉(zhuǎn)染Ad-hBMP9后第7d，ALP染色顯示黑色細(xì)胞數(shù)目多，細(xì)胞胞漿內(nèi)有黑色顆粒，顆粒較大，染色更深。未轉(zhuǎn)染組:細(xì)胞內(nèi)偶見(jiàn)少量黑色顆粒，染色較淡。
　　3.動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn):
　　(1)X線檢查:A組:術(shù)后30天植入?yún)^(qū)有骨痂形成;60天骨痂與斷端宿主骨間界限模糊，骨痂密度不均勻，皮質(zhì)骨輪廓出現(xiàn)，骨缺損已基本消失，有典型的骨愈合影像;90天骨痂已經(jīng)塑形，新生骨皮質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰，與斷端骨自然連接，髓腔基本再通，109天髓腔完

9、全再通。支架材料已經(jīng)基本降解。B組:60天缺損區(qū)有少量骨痂生成，骨缺損處可見(jiàn)有云霧狀高密度影，缺損區(qū)依然存在。109天骨痂已經(jīng)塑形，與斷端骨自然連接，髓腔基本再通，支架材料大部降解。C組:109天骨缺損區(qū)表現(xiàn)為較多骨痂生成影像，斷端連接，但仍然有缺損，髓腔未通，支架材料基本降解。D組、E組:90天缺損區(qū)有少量骨痂生成，骨缺損處可見(jiàn)有云霧狀高密度影，缺損區(qū)依然存在。109天骨痂有所增多，骨斷端連續(xù)性仍未建立。F組:109天缺損區(qū)有少量骨痂

10、生成，少量云霧狀高密度影，支架材料大部已經(jīng)降解。G組:109天骨斷端已完全硬化，橈骨斷端間無(wú)任何連接，呈現(xiàn)骨不連表現(xiàn)。此外，骨缺損愈合的Lane-Sandhu X線評(píng)分顯示，A組評(píng)分顯著高于其他組，B、C兩組也明顯好于D、E、F、G組(P＜0.05)。
　　(2)組織學(xué)檢查:術(shù)后第60天A組骨缺損處可見(jiàn)在支架材料的孔內(nèi)有較多小梁骨形成，新生小梁骨內(nèi)可見(jiàn)骨細(xì)胞散在分布于骨基質(zhì)中。而小梁骨的周圍有正在形成的新生骨組織，可見(jiàn)到骨陷窩散在

11、其中，并觀察到正在降解的團(tuán)塊狀的支架材料。B組的骨缺損處可見(jiàn)在支架材料的大部分微孔內(nèi)有小梁骨形成，骨細(xì)胞散在分布于新生小梁骨內(nèi)的骨基質(zhì)中。術(shù)后109天，A組于骨缺損處大量生成小梁骨，小梁骨之間有骨髓樣組織，形成髓腔，髓腔通暢。B組見(jiàn)較多小梁骨形成，其周邊可見(jiàn)大量正形成的新生的骨組織，髓腔部分通暢。在術(shù)后60天、109天，C組骨缺損處理也見(jiàn)新生骨組織形成。D、E、F組則有少量新骨增生、散在類骨質(zhì)形成。在整個(gè)觀察期間，G組未見(jiàn)有任何成骨現(xiàn)象

12、、斷端封閉。
　　此外，組織學(xué)切片半定量檢測(cè)結(jié)果分析各實(shí)驗(yàn)組骨缺損處成骨面積比例:術(shù)后第60天、109天A組成骨面積比例均顯著高于其他組，B、C組優(yōu)于D、E、F組。其余組對(duì)G組（空白對(duì)照組）均有顯著性差異。(P＜0.05，n=4)
　　(3)生物力學(xué)測(cè)定:術(shù)后第109天取出的實(shí)驗(yàn)橈骨(n=4)行生物力學(xué)測(cè)定結(jié)果顯示:A組的抗折斷力顯著高于其他組，B、C兩組也明顯好于D、E、F、G組(P＜0.05)。
　　結(jié)論：

13、　　1.通過(guò)膠原酶消化+貼壁培養(yǎng)法，體外成功地從脂肪組織中分離、培養(yǎng)出大量的成纖維細(xì)胞樣外觀的兔脂肪干細(xì)胞(ADSCs)。體外培養(yǎng)的兔ADSCs具有純度高，形態(tài)均勻，穩(wěn)定性較好，易于增殖擴(kuò)增等特點(diǎn)。
　　2.本實(shí)驗(yàn)分離、培養(yǎng)的兔ADSCs具有干細(xì)胞的表面分子的特征。
　　3.實(shí)驗(yàn)證實(shí)，重組腺病毒介導(dǎo)的hBMP-9基因體外轉(zhuǎn)染脂肪干細(xì)胞具有較安全、轉(zhuǎn)染效率高的特點(diǎn)，轉(zhuǎn)染Ad-hBMP-9的脂肪干細(xì)胞能有效表達(dá)BMP-9 mRN

14、A。重組腺病毒是一種理想的基因載體。
　　4.轉(zhuǎn)染Ad-hBMP-9后，ADSCs能夠成功地持續(xù)表達(dá)BMP-9。
　　5.Ad-hBMP-9轉(zhuǎn)染脂肪干細(xì)胞后，細(xì)胞依然保持較旺盛的增殖能力，且細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有成骨能力的細(xì)胞。被轉(zhuǎn)染后的hBMP-9基因成功地誘導(dǎo)了ADSCs向成骨細(xì)胞分化。
　　6.本研究證實(shí)，將BMP-9轉(zhuǎn)染的ADSCs復(fù)合攜淫羊藿苷的nHAC支架材料植入兔橈骨15mm節(jié)段性骨缺損中，于術(shù)后第30天、60天