同種異體脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合β-磷酸三鈣支架修復(fù)兔橈骨大段骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本文從以下幾個(gè)部分展開(kāi)論述：
　　第一部分 兔脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)、鑒定以及多向誘導(dǎo)分化研究
　　目的:建立體外分離培養(yǎng)獲得兔脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞(rabbit adipose-derivedmesenchymal stem cells，rADSCs)的方法，并對(duì)其形態(tài)學(xué)、生物學(xué)特性進(jìn)行觀(guān)察并對(duì)其表面標(biāo)志物進(jìn)行鑒定;將分離培養(yǎng)的rADSCs體外誘導(dǎo)，使其向成骨、成脂方向分化，觀(guān)察其多向細(xì)胞分化的潛能。

2、　　方法:切取兔頸背區(qū)皮下脂肪，用0.1％I型膠原酶消化法獲得兔脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)行體外培養(yǎng)，用胰蛋白酶消化法傳代擴(kuò)增。用CCK-8法細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)繪制細(xì)胞增殖曲線(xiàn)。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物。第4代rADSCs經(jīng)成脂誘導(dǎo)后，用油紅O染色，成骨誘導(dǎo)后，分別用茜素紅染色、堿性磷酸酶染色，觀(guān)察其成骨、成脂分化潛能。
　　結(jié)果:rADSCs細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形漩渦樣貼壁生長(zhǎng)，增殖能力強(qiáng)。將第4代rADSCs用分子流式細(xì)胞儀檢測(cè)，可見(jiàn)C

3、D29、CD90、CD44陽(yáng)性率高，而CD34和CD45陽(yáng)性率低。第4代rADSCs在誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)下分化為脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞，成脂誘導(dǎo)后的rADSCs經(jīng)油紅O染色呈陽(yáng)性結(jié)果，成骨誘導(dǎo)后的rADSCs經(jīng)堿性磷酸酶和茜素紅染色均呈陽(yáng)性結(jié)果。
　　結(jié)論:來(lái)源于兔頸背區(qū)的皮下脂肪組織取材相對(duì)容易且可供取材的組織量大，脂肪組織內(nèi)細(xì)胞量充足，可簡(jiǎn)單進(jìn)行體外分離培養(yǎng);兔脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞(rADSCs)在體外增殖速度快，能夠保持穩(wěn)定的傳代，直

4、至第10代;ADSCs具有分化成骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞等多向細(xì)胞分化的潛能，是組織工程骨理想的種子細(xì)胞。
　　第二部分 兔脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞在β-磷酸三鈣支架上體外共培養(yǎng)，構(gòu)建rADSCs/β-TCP骨組織工程復(fù)合體及體外成骨分化的研究
　　目的:將β-磷酸三鈣（β-Tricalcium phosphate，β-TCP）支架與經(jīng)傳代分離獲取的兔脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞在體外共培養(yǎng)，構(gòu)建成rADSCs/β-TCP骨組織工程復(fù)合體，觀(guān)察

5、在組織工程支架上rADSCs向成骨細(xì)胞分化的能力。
　　方法:將體外分離培養(yǎng)的rADSCs接種于β-TCP支架上，從在β-TCP支架上加入細(xì)胞懸液開(kāi)始計(jì)時(shí)，在細(xì)胞培養(yǎng)的第24h開(kāi)始，每24h至第7d進(jìn)行CCK-8檢測(cè)細(xì)胞在材料中的增殖情況，培養(yǎng)7d后用堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)測(cè)定試劑盒檢測(cè)細(xì)胞在材料內(nèi)表達(dá)ALP的情況，以rADSCs直接接種于12孔板培養(yǎng)貼壁生長(zhǎng)作為對(duì)照組，在相同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行細(xì)胞

6、增殖以及ALP活性的檢測(cè)，結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。將rADSCs細(xì)胞懸液接種于β-TCP支架上，在體外共培養(yǎng)3d和7d，在掃描電鏡下觀(guān)察其生長(zhǎng)情況。
　　結(jié)果:經(jīng)CCK-8法檢測(cè)，細(xì)胞在支架材料上增殖的結(jié)果示:各組的吸光度都隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高，與β-TCP支架共培養(yǎng)7d的細(xì)胞與對(duì)照組相比較，第2天、第5天細(xì)胞與支架材料共培養(yǎng)組和對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在支架材料上的細(xì)胞增殖能力較強(qiáng)，其余時(shí)間點(diǎn)的兩組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;并且隨著時(shí)

7、間的延長(zhǎng)，細(xì)胞的增殖不受影響并具有良好的生物學(xué)活性。ALP活性測(cè)定結(jié)果表明，接種的rADSCs細(xì)胞在β-TCP支架上生長(zhǎng)良好，具有較高的ALP活性，與對(duì)照相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，β-TCP具有一定的促進(jìn)細(xì)胞成骨作用。掃描電鏡觀(guān)察細(xì)胞與材料接觸緊密，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形伸展，分布均勻。
　　結(jié)論:β-TCP支架具有良好的生物相容性，rADSCs在支架上共培養(yǎng)時(shí)支架材料不具有細(xì)胞毒性;rADSCs在β-TCP支架上共培養(yǎng)后，細(xì)胞的增殖能力無(wú)明

8、顯減弱，并且仍具有向成骨分化的能力。
　　第三部分 應(yīng)用rADSCs/β-TCP骨組織工程復(fù)合體修復(fù)兔橈骨大段骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:以β-TCP陶瓷為支架材料，復(fù)合兔脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞，探討構(gòu)建組織工程骨修復(fù)骨缺損的可行性。
　　方法:體外培養(yǎng)的兔脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞(rADSCs)接種于β-TCP支架上，構(gòu)建rADSCs/β-TCP骨組織工程復(fù)合體，并進(jìn)行體外培養(yǎng)。制備兔橈骨2cm長(zhǎng)度的節(jié)段性骨缺損模型，分三

9、組進(jìn)行骨缺損治療的研究:空白對(duì)照組（A組）不植入任何材料，單β-TCP人工骨對(duì)照組（B組），rADSCs/β-TCP復(fù)合體實(shí)驗(yàn)組（C組）。各組8只兔16例骨缺損。在手術(shù)后2周，4周，6周和8周時(shí)進(jìn)行X線(xiàn)檢查，按Lane-Sandhu X線(xiàn)評(píng)分法對(duì)骨愈合情況進(jìn)行比較，X線(xiàn)檢查后每組各選2只兔處死后取出標(biāo)本，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行大體觀(guān)察以及進(jìn)行常規(guī)HE染色，光鏡下觀(guān)察骨修復(fù)情況，并觀(guān)察是否發(fā)生免疫排斥反應(yīng)。
　　結(jié)果:通過(guò)Lane-Sandhu

10、 X線(xiàn)評(píng)分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，C組比B組在各時(shí)間點(diǎn)評(píng)分均略高，但其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其兩組的評(píng)分均明顯高于A(yíng)組，手術(shù)后8周結(jié)果示A組與其它兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組織學(xué)觀(guān)察C組在術(shù)后4周可觀(guān)察到骨缺損周?chē)_(kāi)始形成新生骨，并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)新生骨量逐漸增多，在術(shù)后6周時(shí)，材料逐漸降解，材料孔隙內(nèi)有新生骨長(zhǎng)入，在術(shù)后8周時(shí)，材料降解明顯，材料孔隙基本消失，髓腔已基本再通。而至術(shù)后8周，2例B組及4例A組骨缺損未愈合，髓腔不通，與實(shí)驗(yàn)組有明顯差異