甜菜夜蛾和斜紋夜蛾P(guān)BP-GOBP的功能分化研究.pdf

1、夜蛾科昆蟲大多為農(nóng)林重要害蟲，化學(xué)殺蟲劑的持續(xù)和大量使用，不但使害蟲產(chǎn)生了不同程度的抗藥性，而且引起的環(huán)境污染及農(nóng)藥殘留等問題日益突出，亟待開發(fā)新型的無公害替代防治技術(shù)。目前，基于昆蟲嗅覺調(diào)控的害蟲防治策略已經(jīng)在農(nóng)業(yè)害蟲和媒介昆蟲的防治上得到運(yùn)用，但相關(guān)的分子機(jī)制仍然不十分清楚。相比于其他昆蟲，夜蛾科昆蟲的成蟲由于夜間活動(dòng)，其性信息素通訊系統(tǒng)具有更高的靈敏性和種特異性，因此在兩性間的交配和種群繁衍中起到更為重要的作用。
　　性信息

2、素結(jié)合蛋白（PBP）和普通氣味結(jié)合蛋白(GOBP)是鱗翅目昆蟲特有的兩類重要的氣味結(jié)合蛋白(OBP)亞家族，傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為前者參與性信息素分子的結(jié)合和運(yùn)輸，后者則和普通氣味分子的感受有關(guān)。然而，在夜蛾科中，一種昆蟲普遍存在3個(gè)不同的PBP基因和2個(gè)不同的GOBP基因，且這5個(gè)基因在不同種間具有很高的保守性。那么，夜蛾科PBP/GOBP在兩個(gè)亞家族間及亞家族內(nèi)不同成員間的進(jìn)化關(guān)系如何？它們?cè)诠δ苌鲜欠褚旬a(chǎn)生明顯的分化？回答這些問題，不僅有助

3、于深入了解昆蟲的嗅覺機(jī)制及其進(jìn)化，而且可為設(shè)計(jì)和開發(fā)基于嗅覺調(diào)控的害蟲防治新技術(shù)提供指導(dǎo)和潛在靶標(biāo)。本研究以夜蛾科灰翅夜蛾屬兩種重要農(nóng)業(yè)害蟲甜菜夜蛾Spodoptera exigua和斜紋夜蛾Spodoptera litura為對(duì)象，綜合利用分子生物學(xué)、生物信息學(xué)和生物化學(xué)等技術(shù)，對(duì)上述問題進(jìn)行了較為深入的研究和分析。主要結(jié)果如下:
　　1.兩種灰翅夜蛾屬昆蟲化學(xué)感受基因的鑒定和表達(dá)譜分析
　　根據(jù)已公布的甜菜夜蛾和斜紋夜蛾

4、不同發(fā)育齡期的轉(zhuǎn)錄組，利用生物信息學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，鑒定了兩種灰翅夜蛾屬昆蟲中6類主要的化學(xué)感受基因家族。從甜菜夜蛾轉(zhuǎn)錄組中一共鑒定到79個(gè)化學(xué)感受基因，包括34個(gè)OBP、20個(gè)CSP、10個(gè)OR、6個(gè)GR、6個(gè)IR和3個(gè)SNMP;從斜紋夜蛾轉(zhuǎn)錄組中鑒定到80個(gè)化學(xué)感受基因，包括38個(gè)OBP、21個(gè)CSP、8個(gè)OR、4個(gè)GR、6個(gè)IR和3個(gè)SNMP。其中，首次在兩種昆蟲中鑒定到各一個(gè)新的鱗翅目SNMP，根據(jù)序列特征和進(jìn)化分析命名為SN

5、MP3，并在另外3種蛾類昆蟲中得到驗(yàn)證。序列比對(duì)結(jié)果顯示，兩種昆蟲的大部分同源的化學(xué)感受基因具有較高的氨基酸一致性(＞80％)。進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，兩種昆蟲各有3個(gè)Minus-C OBP和3個(gè)Plus-C OBP，其余均屬于Classic OBP(包括PBP/GOBP、CRLBP、ABPⅠ和ABPⅡ)。RT-PCR結(jié)果表明，甜菜夜蛾被測(cè)試的67個(gè)化學(xué)感受基因至少在一個(gè)被測(cè)組織中表達(dá)，且大多數(shù)（約80％）基因在成蟲觸角或幼蟲頭部（含觸角）

6、有表達(dá)，暗示它們?cè)谛嵊X中起作用。
　　2.兩種灰翅夜蛾屬昆蟲PBP/GOBP的基因結(jié)構(gòu)和進(jìn)化分析
　　基于鱗翅目昆蟲已知PBP/GOBP的基因組DNA序列，通過生物信息學(xué)方法分析了25種鱗翅目昆蟲的62個(gè)PBP/GOBP基因序列。結(jié)果表明，所有PBP/GOBP具有2個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子，并且具有保守的內(nèi)含子插入位點(diǎn)。針對(duì)夜蛾科昆蟲PBP/GOBP的進(jìn)化樹分析顯示，PBP/GOBP被分成5個(gè)不同的分支:Group1、2、3、4

7、和5;每一分支內(nèi)的同源基因間具有較高的氨基酸一致性(＞55％)，但不同分支間的一致性較低(＜50％)。選擇壓力分析表明，每一分支內(nèi)的PBP/GOBP都經(jīng)過強(qiáng)的負(fù)選擇(ω＜0.70)，暗示這些同源基因具有保守的功能。另外，對(duì)斜紋夜蛾、棉鈴蟲和煙青蟲的分析表明，每種昆蟲的3個(gè)PBP均位于同一條染色體上，且彼此臨近(相隔2.3～4.0 Kb)，因此很可能由一個(gè)共同祖先通過基因復(fù)制而產(chǎn)生。進(jìn)一步對(duì)斜紋夜蛾的分析顯示，GOBP2與3個(gè)PBP也緊密

8、相鄰位于同一條染色體上(與臨近PBP相隔2.6 Kb)，暗示GOBP2和3個(gè)PBP來自同一個(gè)祖先。3種昆蟲中PBP及PBP和GOBP在染色體上的這種分布也與非夜蛾科昆蟲家蠶、君主斑蝶等相一致，暗示鱗翅目昆蟲PBP/GOBP具有相似的進(jìn)化過程。
　　3.兩種灰翅夜蛾屬昆蟲PBP的功能分化研究
　　在夜蛾科昆蟲中，成蟲兩性間的通訊主要由雌蟲釋放性信息素來遠(yuǎn)距離吸引雄蟲，而雄蟲則依靠其發(fā)達(dá)的嗅覺器官——觸角來感受性信息素并產(chǎn)生趨向

9、雌蟲的定向飛行，因此分析PBP的組織表達(dá)譜和雌雄差異可為功能研究提供重要信息。利用RT-PCR和qPCR對(duì)兩種昆蟲（甜菜夜蛾和斜紋夜蛾）各3個(gè)PBP的測(cè)定結(jié)果顯示，所有PBP均主要在成蟲觸角中表達(dá)，但部分基因在其他組織中也有微量表達(dá);不同PBP在兩性觸角間的相對(duì)表達(dá)量明顯不同:PBP1為雄性顯著高表達(dá)（甜菜夜蛾是5.96倍;斜紋夜蛾是2.70倍）;PBP2和PBP3雌雄間差異不明顯（差異小于2.50倍）。另外，不同PBP在同性觸角間的相

10、對(duì)表達(dá)量也有不同:在雄性觸角中，PBP1表達(dá)量最高、PBP3最低(甜菜夜蛾中PBP1∶PBP2∶PBP3=16.5∶1.5∶1.0;斜紋夜蛾中PBP1∶PBP2∶PBP3=10.0∶3.3∶1.0);在雌性觸角中，3個(gè)PBP表達(dá)水平相當(dāng)(甜菜夜蛾中PBP1∶PBP2∶PBP3=1.1∶1.1∶1.0;斜紋夜蛾中PBP1∶PBP2∶PBP3=2.5∶1.6∶1.0)。由此推測(cè)，PBP1在雌蛾性信息素的感受中起主要作用，PBP2和PBP3則

11、起次要作用。進(jìn)一步利用原核表達(dá)系統(tǒng)、親和層析技術(shù)和熒光競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)，測(cè)定了不同PBP對(duì)性信息素組分的結(jié)合能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3個(gè)PBP均能夠不同程度地結(jié)合性信息素組分，但以PBP1的結(jié)合能力最強(qiáng)、PBP3最低，與3個(gè)PBP的雌雄表達(dá)差異及在雄蟲觸角中的相對(duì)表達(dá)量相一致。此外，3個(gè)PBP均選擇性結(jié)合部分植物氣味，且具有較高的親和力（解離常數(shù)Ki＜10.0μM)。綜上結(jié)果，兩種夜蛾科昆蟲中3個(gè)不同的PBP已產(chǎn)生明顯的功能分化:PBP1在雌蛾性

12、信息素的感受中起主要作用，PBP2和PBP3的作用次要;除感受雌蛾性信息素外，PBP可能還參與植物氣味的感受。
　　4.兩種灰翅夜蛾屬昆蟲GOBP的功能分化研究
　　鱗翅目昆蟲均含有2個(gè)不同的GOBP基因，且在不同種間非常保守，GOBP通常被認(rèn)為在植物氣味的感受中起作用。為了研究2個(gè)GOBP的功能及其差異，對(duì)甜菜夜蛾和斜紋夜蛾的各2個(gè)GOBP基因的表達(dá)譜、氣味結(jié)合特性以及參與配基結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行了系統(tǒng)分析。qPCR結(jié)果表

13、明，2個(gè)GOBP主要在成蟲觸角表達(dá)，且在雌雄觸角間的表達(dá)水平相當(dāng)（差異均小于2.0倍）。進(jìn)一步的配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,GOBP1能夠中等強(qiáng)度地結(jié)合大部分被測(cè)植物氣味(Ki=10～50μM);而GOBP2僅對(duì)部分植物氣味具有較高的親和力（Ki＜5.0μM）。有意思的是，對(duì)于性信息素組分及其類似物，GOBP2也有很強(qiáng)的結(jié)合能力（Ki＜1.5μM），GOBP1則沒有。分子對(duì)接結(jié)果顯示，斜紋夜蛾的GOBP1和GOBP2與配基的結(jié)合涉及到不同的關(guān)

14、鍵氨基酸位點(diǎn);甜菜夜蛾的GOBP2和PBP1與性信息素的結(jié)合具有不同的配基結(jié)合機(jī)制。綜上所述，兩種夜蛾科昆蟲的2個(gè)GOBP具有不同的功能:GOBP1和GOBP2對(duì)應(yīng)不同的植物氣味譜;除植物氣味外，GOBP2可能還參與性信息素的感受。
　　5.兩種灰翅夜蛾屬昆蟲PBP的多聚體存在形式研究
　　在家蠶、舞毒蛾等蛾類昆蟲中，通過對(duì)PBP與氣味分子復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)PBP以同源或異源二聚體的形式參與配基的結(jié)合，以此來提高PB

15、P對(duì)氣味感受的特異性或敏感性。為了研究?jī)煞N昆蟲中3個(gè)PBP的多聚體存在形式，以純化的甜菜夜蛾3個(gè)PBP、斜紋夜蛾P(guān)BP1蛋白和交聯(lián)劑戊二醛為材料，利用化學(xué)交聯(lián)技術(shù)分別研究了SexiPBP1、SexiPBP2、SexiPBP3或SlitPBP1的相互作用。結(jié)果表明，0.5％的戊二醛濃度、30 min的交聯(lián)反應(yīng)時(shí)間和1.0 mg/mL的蛋白濃度是SexiPBP與戊二醛反應(yīng)的最佳條件。在沒有戊二醛存在的條件下，3個(gè)SexiPBP均主要以單體的

16、形式存在(95％)，能夠形成少量二聚體(5％)，但沒有三聚體形成;在加入一定濃度的戊二醛后，3個(gè)SexiPBP形成二聚體的比例增加(9％)，并有一定比例的三聚體形成(1％)。類似的結(jié)果在斜紋夜蛾的PBP1中也有發(fā)現(xiàn)。另外，在不同pH條件下，SexiPBP以單體、二聚體和三聚體混合物的形式存在，但不同pH間三者的比例并沒有明顯的變化。綜上結(jié)果，兩種昆蟲PBP很可能還以同源多聚體的形式結(jié)合環(huán)境中多樣性的氣味分子。
　　綜上所述，甜菜夜