斜紋夜蛾核多角體病毒bro和iap基因的研究.pdf

1、中山大學博士學位論文斜紋夜蛾核多角體病毒bro和iap基因的研究姓名：龔映雪申請學位級別：博士專業(yè)：微生物學指導教師：龐義20050602能檢測到相應大小的特異蛋白帶；BRO—B從感染后12h即有高豐度表達，并一直持續(xù)到96h。間接免疫熒光分析發(fā)現，SpltMNPVBRO—B蛋白特異性地分布于感染病毒的細胞核中；對感染SpltMNPV病毒的細胞進行核組分的分離抽提發(fā)現，BROB能夠與細胞核發(fā)生緊密的結合，可能是～個新的DNA結合蛋白。細

2、胞凋亡抑制蛋白(inhibitorofapoptosisprotein)／ap基因在從桿狀病毒到人類的各個物種中廣泛存在，組成了一個多功能、參與多種細胞途徑的調控蛋白家族。本文通過計算機分析SpltMNPV／ap序列發(fā)現，其氨基端只具有一個桿狀病毒／ap重復模序(BIER模序)，其羧基端具有一個RING模序，在兩者之間存在一個Asp富集區(qū)；SpltMNPVIAP與其它桿狀病毒lAP蛋白的同源性普遍高于與細胞來源的IAP蛋白。用PCR方法

3、擴增得到／ap全部編碼區(qū)并克隆到原核表達載體pQE30上，在IFIG誘導下高效表達了相應分子量大小的6His1AP融合蛋白。純化的融合蛋白作為抗原免疫新西蘭大白兔，制備了anti—IAP多克隆抗體。用病毒感染后不同時間的斜紋夜蛾細胞進行RTPCR分析表明，在離體條件下／ap基因的轉錄從病毒感染后12h持續(xù)到感染后96h；與之相應，用lAP抗體進行Western印跡，從感染后12h到96h能檢測到分子量為32kDa的特異蛋白條帶表達；從感

4、染后48h到96h還能檢測到分子量為16kDa的特異蛋白帶，推測分別是IAP表達蛋白形成的二聚體和單體形式。通過間接免疫熒光分析結合Western印跡結果發(fā)現，SpltMNPVlAP蛋白僅分布于感染病毒的細胞核中。通過構建帶有苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒(Autographacalifomicamulticapsidnucleopolyhedrovirus，AcMNPV)／e』基因啟動子和SpltMNPV／ap基因全部編碼區(qū)及poly(A)

5、加尾酶信號序列的瞬時表達質粒pTPieliap，并轉染草地貪夜蛾細胞Sf9進行瞬時表達，在轉染后24小時用lAP抗體進行Westernblot印跡能檢測到蛋白表達；用AcMNPV缺失p35基因的自然突變株vAcAnh感染Sf9細胞，結合形態(tài)學觀察、生理生化檢測發(fā)現，在感染后24小時，不轉染質粒細胞出現凋亡現象，而轉染pTPieliap的細胞沒有凋亡現象出現；在感染后48小時，不轉染質粒的對照細胞大部分出現晚期凋亡及壞死現象，轉染pTPi