楷杷葉的ISSR遺傳差異分析及化學(xué)成分含量相關(guān)性研究.pdf

1、目的:
　　 采用ISSR-PCR對源于不同枇杷品種的枇杷葉進(jìn)行遺傳差異分析,并研究枇杷葉中化學(xué)成分含量與其ISSR-PCR特征圖譜的相關(guān)性。
　　 方法:
　　 1、從福建莆田采集24份不同品種枇杷嫩葉,采集現(xiàn)場用冰壺保存,實驗室置低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>　　 2、采用改進(jìn)的CTAB法提取分離枇杷葉總基因組DNA,并分別用0.8％瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度法檢測DNA濃度與純度。
　　 3、分別

2、篩選ISSR-PCR擴(kuò)增的模板濃度、Taq酶用量、引物濃度及dNTP濃度,優(yōu)化ISSR-PCR擴(kuò)增體系。
　　 4、首先從隨機(jī)引物中篩選出能產(chǎn)生清晰條帶的引物,再從中篩選出重復(fù)性好、多態(tài)性豐富的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲取ISSR-PCR特征圖譜并進(jìn)行多態(tài)性分析。
　　 5、應(yīng)用聚類分析軟件NTSYS-pc2.10對ISSR擴(kuò)增所得的多態(tài)性位點進(jìn)行分析,得到遺傳相似矩陣并分析不同品種枇杷葉間的遺傳分化差異,UPGMA聚類法構(gòu)

3、建類聚關(guān)系樹狀圖。
　　 6、采用HPLC測定24份不同品種枇杷葉中齊墩果酸和熊果酸含量,并研究化學(xué)成分含量與其ISSR-PCR特征圖譜的相關(guān)性。
　　 結(jié)果:
　　 1、采用改良的CTAB法提取分離枇杷葉總基因組DNA,電泳后呈現(xiàn)一條遷移率很小的整齊條帶,無彌散的熒光區(qū)出現(xiàn),所提取的DNA樣品純度高,無降解和RNA污染,適合進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增。
　　 2、通過對模板DNA濃度、TaqDNA聚合酶用

4、量、引物濃度、dNTP濃度的考察,優(yōu)化PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為:總反應(yīng)體積為25μl,其中模板DNA量為60ng,TaqDNA聚合酶用量為0.9U,引物終濃度為0.4μmol·l-1,dNTP終濃度為200μmol·l-1,10×Buffer為2.5μl,加入滅菌去離子水至25μl。ISSR-PCR反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)采用如下程序:預(yù)變性94℃7min,變性94℃1min,復(fù)性57℃1min,延伸72℃1min,35個循環(huán),72℃延伸10min。

5、
　　 4、從100條ISSR引物中篩選出多態(tài)性豐富的14條引物,共擴(kuò)增出條帶數(shù)150條,其中多態(tài)性條帶79條,占擴(kuò)增總帶數(shù)的52.67％,每個多態(tài)性引物分別能擴(kuò)增出7-16條的條帶,其中多態(tài)性條帶數(shù)3-9條,多態(tài)性比例41.67％-61.53％。不同引物對同一枇杷葉樣品總DNA擴(kuò)增得到的電泳圖譜不同,同一引物對不同品種的枇杷葉樣品總DNA擴(kuò)增得到的電泳圖譜也不相同。引物S859、S822、S856,S818擴(kuò)增特異性條帶豐富,

6、多態(tài)百分率高,是具有鑒別意義的ISSR-PCR特征圖譜。
　　 5、不同品種枇杷葉樣品的遺傳相似系數(shù)在0.1052-0.9473之間,聚類分析表明,當(dāng)相似系數(shù)為0.685時,24個不同品種枇杷葉分可為五個分支,出現(xiàn)明顯的遺傳分化,具有遺傳多樣性。
　　 6、不同品種枇杷葉的齊墩果酸和熊果酸含量差異較大,而且齊墩果酸和熊果酸含量具有平行關(guān)系?；钚猿煞趾颗cISSR-PCR特征圖譜相關(guān)性研究表明,在引物S818中,齊墩果酸和

7、熊果酸含量低的枇杷葉ISSR-PCR圖譜在近400bp與500bp之間缺失一條電泳帶,而含量高的枇杷葉都有這條帶,故該條電泳帶為與其化學(xué)成分含量相關(guān)的特異性帶。ISSK-PCR圖譜顯示親緣關(guān)系相近的枇杷葉中齊墩果酸和熊果酸含量相似,兩者具有相關(guān)性。
　　 結(jié)論:
　　 1、源于不同批杷品種的枇杷葉存在明顯的遺傳分化,ISSR可作為不同品種枇杷葉鑒別的有效分子標(biāo)記。
　　 2、不同品種枇杷葉的齊墩果酸和熊果酸含量差