中藥楷杷葉DNA甲基化及其與化學(xué)成分相關(guān)性研究.pdf

1、目的:采用高效液相色譜法(HPLC)及甲基敏感擴(kuò)增多態(tài)性(MSAP)分子標(biāo)記技術(shù)分析枇杷葉的甲基化情況，并研究枇杷葉中的主要化學(xué)成分熊果酸和齊墩果酸與甲基化情況的相關(guān)性。
　　方法:
　　1.從福建采集43份枇杷嫩葉及成熟掛樹葉，嫩葉采集時用冰壺保存。
　　2.根據(jù)枇杷葉化學(xué)成分特性，改良傳統(tǒng)的CTAB法提取分離總基因組DNA，以獲得較純凈的DNA;并用紫外分光光度法及瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA純度與濃度。

2、　　3.70％高氯酸酸解法水解總基因組DNA，95℃水浴50min分離堿基片段與蛋白質(zhì)等其他雜質(zhì)。反相高效液相色譜法檢測胞嘧啶及5-甲基胞嘧啶的含量，并計算甲基化率。
　　4.采用正交設(shè)計的方法分別對MSAP的主要步驟即預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增的主要因素進(jìn)行優(yōu)化，最后采用敏感性和分辨率均較高的6％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染顯色檢測選擇性擴(kuò)增結(jié)果，根據(jù)條帶的不同位置分析甲基化類型和情況。
　　5.反相高效液相色譜法測定枇杷葉中主要

3、化學(xué)成分熊果酸與齊墩果酸的含量。
　　6.采用SPSS18.0及Origin8.0等進(jìn)行統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果:
　　1.采用改良的CTAB法提取的DNA主帶明顯，無雜帶，OD260/280在1.98～2.15之間表明無蛋白質(zhì)等雜質(zhì)干擾，OD260/230在1.79～2.25間表明無多糖、多酚等雜質(zhì)，純度較高，可以用于之后的分析。
　　2.采用的高效液相色譜條件可以將胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶分離，根據(jù)公式甲基化率=5

4、mC/(5mC+C)％，計算甲基化率，結(jié)果表明43份樣品的甲基化率在4.97％～33.21％。
　　3.通過正交試驗得到最佳的預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系即鏈接產(chǎn)物用量為3μL，E00、H00各105ng，dNTPs0.25mmol/L，TaqDNA聚合酶2U，及最佳的選擇性擴(kuò)增反應(yīng)體系即1.5UTaqDNA聚合酶、0.25mmol/LdNTPs、引物37.5pmol、Mg2+2mmol/L、連接產(chǎn)物稀釋30倍。通過驗證該反應(yīng)條件下能得到較多清

5、晰的條帶，可以用于枇杷葉甲基化情況的分析。
　　4.NTsys-pcversion2.10e軟件對MSAP分析結(jié)果表明19個樣本間的相似系數(shù)在0.6125～0.9625之間，總甲基化率在3.24％～6.73％之間。
　　5.HPLC法測定枇杷葉中熊果酸及齊墩果酸含量表明不同品種間含量差異較大，總均值表明白梨品種的齊墩果酸及熊果酸含量均最高，熊果酸烏躬白品種含量最低，熊果酸解放鐘品種含量最低。
　　結(jié)論:
　　1.

6、DNA甲基化受品種及地理因素的影響。本實驗將6個品種及4個產(chǎn)地的枇杷嫩葉進(jìn)行甲基化分析，表明品種間及產(chǎn)地間的甲基化水平有顯著性差異。華亭產(chǎn)枇杷葉甲基化率最高，長基產(chǎn)枇杷葉的最低。
　　2.不同品種枇杷葉的甲基化模式不同，早鐘6號的甲基化類型以全甲基化為主，而解放鐘則以半甲基化為主。
　　3.對枇杷葉中熊果酸、齊墩果酸與半甲基化率、全甲基化率均成一定的負(fù)性相關(guān)。但不能確定是否與總甲基化率有相關(guān)性。
　　4.根據(jù)HPLC與