抗內(nèi)毒素IgY拮抗內(nèi)毒素損害相關(guān)機制的研究.pdf

1、嚴重燒傷后，包括粘膜機械屏障、固有菌群微生態(tài)屏障和免疫屏障在內(nèi)的腸道三大屏障功能均有不同程度的下降，尤其是大面積嚴重的燒傷病人往往會更加明顯和突出。另外，來源于創(chuàng)面的細菌也會產(chǎn)生大量細菌內(nèi)毒素入血，這些均因素可以導(dǎo)致或者增加細菌內(nèi)毒素(LPS)進入血液循環(huán)，爆發(fā)內(nèi)毒素血癥(intestinal endotoxemia，ITEM)，導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征(system inflammation response syndrome)、多器官

2、功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome)，甚至死亡。但是目前尚無有效的拮抗內(nèi)毒素的藥物應(yīng)用于臨床?？股氐膽?yīng)用雖然能夠有效控制細菌感染，但是卻可能因抗生素對細菌菌體的破壞作用反而促進了內(nèi)毒素的釋放，增加了內(nèi)毒素血癥的危險；器官支持、重癥監(jiān)護技術(shù)和透析治療，以及抗炎性細胞因子單克隆抗體或炎性細胞因子受體拮抗劑等技術(shù)和新藥的使用也沒有明顯降低內(nèi)毒素血癥患者的病死率。有文獻表明應(yīng)用健康志愿者的多

3、克隆免疫血漿可以顯著降低內(nèi)毒素血癥患者的死亡率，但是其來源受到極大的限制而無法大規(guī)模應(yīng)用于臨床治療。不過，多克隆抗體還是被人們寄予了很大的期望，因為內(nèi)毒素是個結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大分子物質(zhì)，有著眾多可能完全不同的表位，而單克隆抗體卻因為太高的專一性，限制了其識別其他的表位，從而降低了其使用的臨床效果，多克隆抗體卻由于可以識別更多的不同表位，覆蓋了更多的潛在結(jié)合點，更有利于發(fā)揮抗體的結(jié)合拮抗功能，提高臨床治療效果。
　　 卵黃抗體是來源于免

4、疫雞蛋的一種免疫球蛋白，以產(chǎn)量高、制備工藝相對簡單、成本較低以及良好的穩(wěn)定性和特異性等優(yōu)點逐步被人們所重視，國內(nèi)外眾多的研究也證明該免疫球蛋白對相應(yīng)的抗原有較強的結(jié)合拮抗作用，因此IgY技術(shù)的研究和開發(fā)也獲得了重要的進展。目前，IgY技術(shù)已經(jīng)在免疫學檢測、預(yù)防和治療細菌、真菌及病毒感染、腫瘤抑制等方面發(fā)揮著日益重要的作用。更重要的是IgY是來源于禽類的多克隆抗體，由于種系差異，研究發(fā)現(xiàn)IgY可以識別更多哺乳動物不能識別的表位，從而增強了

5、其發(fā)揮中和拮抗效應(yīng)的功能。我們前期的研究結(jié)果已經(jīng)顯示出抗內(nèi)毒素IgY良好的拮抗內(nèi)毒素功能。當給與嚴重燒傷后腸源性內(nèi)毒素損傷小鼠口服抗內(nèi)毒素卵黃抗體治療后，小鼠循環(huán)血中TYF-a、IL-6及IL-1β水平較未接受抗內(nèi)毒素卵黃抗體治療組顯著顯著下降，小鼠死亡率也顯著降低；另有文獻報道，當腹腔注射大腸桿菌后小鼠，小鼠體重下降，外周血中WBC和PLT數(shù)均有不同程度的下降，七天死亡率可達100％。當給予特異性IgY腹腔注射保護后，小鼠的上述各項指

6、標較快恢復(fù)到正常水平，七天死亡率顯著下降，且治療效果呈現(xiàn)出特異性IgY的劑量依賴性。聶榮慶等報道特異性IgY可顯著提高中性粒細胞吞噬滅活金黃色葡萄球菌的吞噬率和吞噬指數(shù)，且同樣表現(xiàn)出IgY的劑量依賴性。國外也有眾多文獻報道特異性IgY可以顯著改善相應(yīng)病原菌感染損傷程度的報道，其具體作用機制尚缺乏了解。本研究旨在獲得高純度、高效價的抗內(nèi)毒素IgY并對其拮抗內(nèi)毒素損害的相關(guān)機制進行探討。
　　 本研究用純品LPS配合使用完全弗氏佐劑

7、與不完全弗氏佐劑采用皮下注射和肌肉注射相結(jié)合的多點免疫法免疫產(chǎn)蛋羅曼雞，分別采用改良水溶法(WD法)、硫酸鈉分級沉淀法和凝膠層析法從蛋黃液中制備、提取、純化特異性抗內(nèi)毒素IgY，并對其產(chǎn)量、純度、抗體效價等進行檢測，結(jié)果顯示通過上述方案可以獲得高純度、高效價的抗內(nèi)毒素IgY；小鼠動物實驗顯示體外共孵育抗內(nèi)毒素IgY和LPS后，腹腔注射LPS的致死效應(yīng)顯著降低，抗內(nèi)毒素IgY可以顯著提高腹腔注射LPS攻擊下的小鼠生存率；體外實驗顯示抗內(nèi)毒

8、素IgY可以顯著提高PMA誘導(dǎo)的THP-1細胞吞噬熒光微球的能力，而未免疫IgY卻不能。體內(nèi)研究也發(fā)現(xiàn)當連續(xù)七天腹腔注射給予抗內(nèi)毒素IgY后，小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬功能顯著增強，其吞噬熒光微球的吞噬率和吞噬指數(shù)顯著提高，與未免疫IgY組和PBS組相比差異顯著。另外，抗內(nèi)毒素IgY可以在體外顯著抑制PMA誘導(dǎo)的THP-1細胞分泌TNF-a的能力，還可以顯著抑制LPS攻擊THP-1細胞產(chǎn)生TNF-a的能力且當LPS攻擊一小時后再使用抗內(nèi)毒素

9、IgY同樣可以顯著抑制上述細胞TNF-a的分泌。但流式細胞術(shù)檢測顯示抗內(nèi)毒素IgY并不能顯著降低PMA誘導(dǎo)的THP-1細胞表面CD14的表達，而TLR4的表達所受到的影響也很小；體外細胞實驗還證實當抗內(nèi)毒素IgY與FITC-LPS共孵育后，F(xiàn)ITC-LPS與PMA誘導(dǎo)的THP-1細胞結(jié)合率顯著下降，說明抗內(nèi)毒素IgY可以顯著抑制LPS與靶細胞的結(jié)合。這可能也是抗內(nèi)毒素IgY抑制PMA誘導(dǎo)THP-1細胞分泌TNF-a能力的原因之一。

10、>　　 根據(jù)本研究的實驗結(jié)果結(jié)合以前研究結(jié)果，我們可以看出抗內(nèi)毒素IgY有較好的拮抗LPS損傷作用，其機制可能是1，抗內(nèi)毒素IgY可以增強巨噬細胞等機體吞噬細胞的吞噬功能，增強機體清除致病因子的能力；2，抗內(nèi)毒素IgY可以通過某種路徑，在不能影響CD14或TLR4表達的情況下顯著抑制內(nèi)毒素攻擊下巨噬細胞分泌TNF-a等炎癥介質(zhì)的能力，減輕炎癥反應(yīng)程度；3，抗內(nèi)毒素IgY可以識別、結(jié)合細菌內(nèi)毒素，并有效抑制內(nèi)毒素與巨噬細胞等靶細胞的結(jié)合