抗內(nèi)毒素IgY-F（ab＇）-,2-的制備與體外生物學(xué)效應(yīng)研究.pdf

1、燒傷后腸道三大屏障功能均有不同程度下降，包括腸粘膜機(jī)械屏障損害，出現(xiàn)粘膜糜爛及潰瘍；腸道內(nèi)固有菌群失調(diào)；全身免疫系統(tǒng)功能降低，腸腔內(nèi)sIgA水平下降。這些因素造成了腸腔內(nèi)細(xì)菌和內(nèi)毒素(lipopolysacchoride，LPS)進(jìn)入血液循環(huán)，即細(xì)菌和LPS移位，形成菌血癥或內(nèi)毒素血癥(intestinalendotoxemia，ITEM)，這是導(dǎo)致全身性感染及多器官功能哀竭的重要原因之一，但目前尚無特別有效的拮抗LPS的藥物應(yīng)用于臨床

2、。近年來，發(fā)現(xiàn)在雞蛋的蛋黃中富含來源于雞血清的免疫球蛋白(immunoglobulinG，IgG)，國際上命名為immunoglobulinyolk(IgY)，其含量遠(yuǎn)高于血清，且對(duì)相應(yīng)的抗原有較強(qiáng)的拮抗作用。而IgY含有F(ab’)2段和Fc段，其中F(ab’)2段具有完全的抗體活性，而Fc段可引起過敏反應(yīng)。本研究旨在尋求一種既能有效拮抗LPS，又能減少過敏反應(yīng)的新藥。 本研究用LPS免疫純系來亨(Leghorn)雞，通過改良

3、水溶法(waterdissolveWD法)從蛋黃中提取、純化特異性抗內(nèi)毒素免疫球蛋白IgY，再用胃蛋白酶將IgY酶切為F(ab’)2段和Fc段，F(xiàn)c段進(jìn)一步被胃蛋白酶切為無功能的小分子片段，純化抗內(nèi)毒素IgY-F(ab’)2并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定。 光密度法檢測(cè)抗內(nèi)毒素IgY-F(ab’)2含量為1.04mg/mL蛋黃液，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)抗內(nèi)毒素IgY-F(ab’)2效價(jià)為1：25600，SDS-聚丙烯酰胺凝

4、膠電泳檢測(cè)其分子量為24KD、純度為90％，免疫印跡法(Western-blotting)測(cè)定其與雞血清中的IgG有相同的抗原性。 抗內(nèi)毒素IgY-F(ab’)2系通過大腸埃希菌來源之LPS免疫雞制備，研究中培養(yǎng)了銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、普通變形桿菌四種臨床常見致病菌，通過酚水法提取四種致病菌來源的LPS，通過內(nèi)毒素定量檢測(cè)證實(shí)大腸埃希菌來源之LPS免疫雞制備之抗內(nèi)毒素IgY-F(ab’)2對(duì)其他細(xì)菌(銅綠假單胞

5、菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、普通變形桿菌)來源之LPS均有拮抗作用，且當(dāng)IgY-F(ab’)2劑量為0.5mg/mLLPS時(shí)對(duì)其有較強(qiáng)的生物學(xué)效應(yīng)。 LPS通過其活性中心脂質(zhì)A(LipidA)與效應(yīng)細(xì)胞結(jié)合后，導(dǎo)致單核/巨噬細(xì)胞活化釋放腫瘤壞死因子(Tumornecrosisfactor,TNF-α)和白細(xì)胞介素(Interleukin,IL-6)等細(xì)胞因子，介導(dǎo)全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemicinflammatoryre

6、sponsesyndrome，SIRS)和膿毒癥的發(fā)生，TNF-α和IL-6是造成機(jī)體病理損害的主要炎癥介質(zhì).本研究通過TNF-α和IL-6含量改變，證實(shí)抗內(nèi)毒素IgY-F(ab)2可以保護(hù)LPS對(duì)人外周血單核細(xì)胞的攻擊。通過熒光顯微鏡觀察抗內(nèi)毒素IgY-F(ab)2可以拮抗異硫氰酸熒光素內(nèi)毒素(Fluoresceinisothiocyanate-LPS，F(xiàn)ITC-LPS)與人外周血單核細(xì)胞(Humanperibloodmonocyte