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文檔簡介
1、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),也稱為內毒素(endotoxin)是內毒素血癥(endotoxemia)及膿毒癥(sepsis)最主要的致病因子。LPS致病作用的關鍵在于其通過激活Toll樣受體4(toll like receptor4,TLR4)跨膜信號通路,活化宿主免疫細胞,促進細胞因子和炎癥介質的過度釋放,導致機體組織損傷、多器官衰竭甚至死亡。因此,抑制TLR4跨膜信號通路的激活是防治LPS誘導的過度炎癥反
2、應的有效策略。
LPS誘導TLR4跨膜信號通路的激活受到多種信號蛋白/受體的調控,其中脂多糖結合蛋白(LPS-binding protein,LBP)、CD14、髓樣分化蛋白-2(Myeloid differentiationprotein-2,MD-2)和TLR4是最重要的調控分子。LBP是介導LPS與靶細胞表面受體CD14結合的重要載體蛋白,可催化放大LPS誘導的炎癥級聯反應100~1000倍,是導致膿毒癥患者死亡的主
3、要原因之一。而MD-2則被認為是LPS激活TLR4跨膜信號通路所必需的受體分子,在該通路調控過程中發(fā)揮著不可替代的作用。對于TLR4跨膜信號通路活化的拮抗研究,LBP和MD-2可能是其中最為合理的關鍵治療靶點。
基于此,本研究擬在既往工作基礎上,分別以TLR4跨膜信號通路中兩個最為關鍵的調控蛋白(載體LBP和受體MD-2)為目標分子,利用生物信息學分析蛋白結構與功能的關系,設計構建新的針對LBP和MD-2的小分子內毒素拮抗
4、肽,并對其體外和體內抑制LPS誘導的過度炎癥反應及可能機制進行初步研究,以期獲得具有高拮抗LPS活性的內毒素拮抗肽,為膿毒癥的防治提供有益的探索和嘗試。
主要實驗方法與結果:
1.以TLR4跨膜信號通路的關鍵載體LBP第91-108位氨基酸殘基組成的多肽,即內毒素結合肽(endotoxin binding peptide,EBP)為親代模板,基于增加EBP的疏水性、正電荷數,構建合理的兩親性小分子多肽的設計原
5、則,通過氨基酸替換構建了一組內毒素結合肽突變體(mutants of endotoxin binding peptide,mEBPs);采用9-芴甲氧羰基(Fmoc)固相合成法合成EBP、mEBPs以及對照肽(EBP scrambled peptide,ESP),并利用顯色基質鱟試劑法(CE-TAL)從中篩選獲得1條比EBP中和LPS活性更強的突變體mEBP9(氨基酸序列為:WKVRASFFKLKGSFKVSV)。
2.體
6、外活性檢測結果顯示mEBP9呈劑量依賴性中和LPS活性,并可競爭性抑制rLBP與LPS結合,抑制效應明顯強于EBP(P<0.05)。進一步的細胞學實驗顯示mEBP9可顯著抑制人THP-1細胞(經豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯(phorbol myristate acetate,PMA)誘導分化為成熟巨噬細胞)和小鼠RAW264.7細胞對LPS刺激的過度反應,明顯降低效應細胞TNFG-α和IL-6分泌及TNF-α mRNA表達水平(P<0.05)
7、;且對該兩種細胞生長均無可見的毒副作用。
3.體內生物學效應評估顯示mEBP9對LPS誘導的小鼠急性肺損傷模型具有比EBP更好的保護效應,可明顯降低LPS刺激24h后小鼠支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)內的中性粒細胞和巨噬細胞數量、總蛋白及TNF-α水平(P<0.05),明顯減少小鼠肺部支氣管周圍和肺泡間隔內的炎性細胞浸潤。而且,mEBP9還可明顯降低燒傷合并內毒素血癥
8、模型小鼠48h死亡率,降低血清轉氨酶ALT和AST活性及TNF-α水平(P<0.05)。
4.針對TLR4跨膜信號通路的必需受體MD-2,在分析其結構與功能的關系基礎上,設計構建了1條新的源于MD-2蛋白本身的模擬肽(MD-2 mimetic peptide,MDMP),其氨基酸序列為:CHGHDDDYSFCFSFEGILFPKGHYR,由理論上推測的MD-2蛋白的兩個獨特的功能結構域組成:MD-2與TLR4的結合域(Cy
9、s95-Cys105)及MD-2與LPS的結合域(Phe119-Lys132)。
5.ELISA直接結合及鱟試劑中和試驗顯示,經Fmoc固相合成的MDMP不僅可與LPS結合,還呈劑量依賴性抑制LPS誘導的LAL活化,而對照肽(MD-2 scrambledpeptide,MDSP)則無類似效應。進一步研究發(fā)現用MDMP預處理可明顯減弱RAW264.7細胞對LPS刺激的反應,包括下調RAW264.7細胞表面TLR4-MD-2復
10、合體的表達、抑制FITC-LPS與RAW264.7細胞的結合、降低MAPKs和NF-κB信號通路的活化及TNF-α分泌水平(P<0.05)。
6.在LPS誘導的小鼠急性肺損傷模型中,MDMP預處理可顯著減少LPS刺激24h后支氣管肺泡灌洗液(BALF)內中性粒細胞和巨噬細胞數量、總蛋白和TNF-α分泌水平(P<0.05);并減少小鼠肺組織的炎性細胞浸潤。MDMP預處理對LPS/D-GalN誘導的小鼠急性肝損傷亦具有保護效應
11、,可顯著降低模型小鼠死亡率、減少肝組織內炎癥反應和肝細胞壞死、降低血清ALT、AST活性和TNF-α水平(P<0.05)。
結論:
1.利用生物信息學技術對LBP的LPS結合位點肽段進行選擇性突變和改建,成功篩選獲得比親代EBP拮抗LPS活性更強的突變體mEBP9。活性檢測分析顯示,mEBP9可能是通過直接中和LPS及競爭性阻斷LBP與LPS結合,從而在體內外抑制LPS誘導的過度炎癥反應。該研究結果為以抑制L
12、BP的催化放大效應為靶標的膿毒癥防治策略提供了新的實驗依據。
2.基于蛋白質結構與功能的關系而設計構建的MD-2模擬肽(MDMP)可在體外和體內抑制LPS誘導的過度炎癥反應,MDMP的這種拮抗效應可能與其中和LPS活性、下調TLR4-MD-2復合體表達以及降低MAPKs和NF-κB信號激活有關,提示針對MD-2的拮抗治療是抑制TLR4跨膜信號通路激活的有效途徑之一,為膿毒癥的防治提供了新的研究思路。
3.上述
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