人內(nèi)毒素結(jié)合肽突變體的構(gòu)建及其抗內(nèi)毒素活性研究.pdf

1、內(nèi)毒素(lipopolysaccharide,LPS)激活單核/巨噬細(xì)胞引起的細(xì)胞因子過度釋放是臨床上全身性炎癥反應(yīng)綜合征(systemicinflammatoryresponsesyndrome，SIRS)或膿毒癥的主要觸發(fā)因素。SIRS或膿毒癥具有較高的發(fā)病率與死亡率，而臨床上目前尚無有效的防治措施，所以針對該問題的防治性研究一直是臨床醫(yī)學(xué)關(guān)注的熱點。 脂多糖結(jié)合蛋白(lipopolysaccharidebindingpro

2、tein，LBP)對LPS的毒性作用具有催化放大效應(yīng)，含有特異性LPS結(jié)合位點的多肽可以通過阻斷LBP-LPS相互作用來拮抗LPS的毒性作用，是抗內(nèi)毒素作用的有效手段。LPS分子具有富含負(fù)電荷磷酸基團(tuán)及疏水性長鏈脂肪酸的特征，容易結(jié)合帶正電荷及疏水性較強(qiáng)的分子。國外多項研究報道，LBP、BPI及LALF等天然內(nèi)毒素結(jié)合蛋白的衍生肽均具有高正電荷數(shù)及疏水性，可以通過阻斷LPS與LBP的結(jié)合來抑制LPS誘發(fā)的體內(nèi)外炎性反應(yīng)。目前已經(jīng)明確，L

3、BP109-133氨基酸區(qū)域是LBP與內(nèi)毒素結(jié)合的主要區(qū)域，對應(yīng)于此區(qū)域的多肽(命名為EBP)經(jīng)本室以前的研究證實具有中和內(nèi)毒素活性。在此基礎(chǔ)上，為了進(jìn)一步提高其生物活性，作者借助于DNAsis軟件，設(shè)計了具有更強(qiáng)正電荷及疏水性的突變體mEBP，使其更易于結(jié)合LPS；并對EBP及mEBP進(jìn)行克隆表達(dá)以研究其抗內(nèi)毒素活性。 實驗中將EBP一級結(jié)構(gòu)中的酸性及中性氨基酸用賴氨酸替換后，應(yīng)用DNAsis軟件計算預(yù)突變體的等電點與疏水性，

4、篩選具有高正電荷數(shù)及疏水性的突變體-mEBP；通過基因定點誘變技術(shù)獲得mEBP對應(yīng)的基因片斷，構(gòu)建PinpointXa3-mEBP表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化DH5α菌，在此基礎(chǔ)上篩選目的基因高表達(dá)株，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；對以包涵體形式表達(dá)的兩種蛋白進(jìn)行分離并親和層析純化；經(jīng)凝血酶Xa切割獲得2種目的肽EBP及mEBP，兩步純化后對mEBP進(jìn)行氨基末端10個氨基酸序列測定；最后應(yīng)用新鮮人外周血分離的單個核細(xì)胞及燒傷復(fù)合內(nèi)毒素血癥小鼠進(jìn)行體內(nèi)外抗內(nèi)毒素活

5、性檢測，對比研究EBP及mEBP的生物學(xué)功能。 主要研究結(jié)果及結(jié)論如下： 1.EBP基因第13，54位C替換為A，對應(yīng)肽的5，18位谷氨酰胺替換為賴氨酸后，DNAsis分析等電點由突變前的12，24變?yōu)?2.26，所帶正電荷數(shù)由+6增至+8，平均疏水性由0.13增為0.33，確定為預(yù)突變體。 2.以含EBP基因的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR定點突變，獲得突變體mEBP基因，將其克隆入原核融合表達(dá)載體PinpointXa-

6、3，經(jīng)酶切及測序鑒定，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒。 3.氯化鈣法將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選轉(zhuǎn)化克隆，以0.2mmol/LIPTG誘導(dǎo)2種融合蛋白表達(dá)5小時，優(yōu)化表達(dá)條件，結(jié)果目的蛋白以包涵體形式獲得高表達(dá)。SDS-PAGE電泳及Western-blot鑒定結(jié)果顯示在16.5kD位置有特異性蛋白條帶。 4.分離溶解包涵體獲得融合蛋白，用抗生物素樹脂SoftlinkTMReleaseAvidinResin親和層析純化，得到濃

7、度大于85％的融合蛋白。因子Xa切割融合蛋白使目的肽與融合伴侶分開，親和層析純化及反相高壓液相色譜純化，分別獲得98％以上純度的EBP與mEBP。 5.對比研究EBP與mEBP的體內(nèi)外生物活性： (1)mEBP較等濃度EBP具有更好的結(jié)合內(nèi)毒素能力。 (2)12.5ug/ml的EBP及2、5、12.5ug/ml的mEBP均有明顯抑制單核細(xì)胞分泌IL-6及TNF-α的作用(IL-6:P＜0.01；TNF-α：P＜0

8、.01)；5μg/ml的EBP僅有抑制IL-6釋放的作用，而12.5ug/ml的mEBP作用后細(xì)胞因子濃度(IL-6:37.3±5.3，TNF-α：53.3±0.9)與陽性對照PMB作用后無明顯差異(IL-6:43.6±6.9,TNF-α：49.7±5.5)(P＞0.05)。 (3)在模型小鼠體內(nèi)，5mg(kg及10mg/kg濃度的mEBP或EBP均有顯著抑制細(xì)胞因子釋放的效應(yīng)，其中5mg/kgmEBP處理組小鼠體內(nèi)細(xì)胞因子濃度

9、(IL-6:168±26，TNF-α：295±38)顯著低于等濃度EBP處理組(IL-6:301±42,TNF-α：541±43)(P＜0.05)。RT-PCR半定量分析結(jié)果還顯示，10mg/kgmEBP具有較強(qiáng)抑制小鼠肝組織內(nèi)TNF-αmRNA表達(dá)的作用。對小鼠存活率影響方面，5mg/kg及10mg/kgmEBP處理后，與模型組相比，小鼠存活率分別上升了20％及40％，而EBP處理組對小鼠存活率沒有影響。肝、肺、腎的病理組織學(xué)改變可見