制動對大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨的時空影響.pdf

1、作為人體最常見的關(guān)節(jié)疾病[14,15]，關(guān)節(jié)軟骨的退化是OA最典型的特征之一，也是關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)和運動功能損傷的病理基礎(chǔ)[16]。膝關(guān)節(jié)作為人體活動量最大的負重關(guān)節(jié)，是人體退行性病變發(fā)生最常見的部位。這種風險在老年人中尤為突出，因為膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis of knee，KOA)導致關(guān)節(jié)活動能力喪失的危險性，大于其他所有醫(yī)療疾患的總和[17]。然而，當前越來越多的觀點認為除了關(guān)節(jié)軟骨，軟骨下骨(subchondral

2、bone)病理生理的改變也是OA產(chǎn)生的重要因素之一[4,6，16，18，19]。但是，對于軟骨下骨和關(guān)節(jié)軟骨在OA發(fā)病機制中各自所起到的作用及其相互關(guān)系，仍然存在很多問題尚不明確。比如，對于軟骨下骨的病變究竟是早于還是晚于關(guān)節(jié)軟骨依舊存在很大爭議。雖然以往很多實驗探討了兩者病變發(fā)生的先后關(guān)系，但是得到的結(jié)論并不一致:它們發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨的變化可能早于、晚于或者同時伴發(fā)于關(guān)節(jié)軟骨的病變[20-22]。導致這些不一致結(jié)果的原因可能是多方面的，比

3、如各個研究所采用的OA模型的差異，OA處于不同的疾病進展期，或是它們所采用實驗動物模型的差異。
　　過去的研究發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨之間在代謝層面上存在著極其復雜的聯(lián)系(coupling)，關(guān)節(jié)軟骨的完整性可能會受到軟骨下骨重塑(boneremodeling)的影響。此外，許多證據(jù)表明關(guān)節(jié)制動可能會引發(fā)關(guān)節(jié)軟骨的萎縮[11]，但是目前人們對于制動對軟骨下骨的作用，以及軟骨下骨在關(guān)節(jié)軟骨退化過程中所扮演的角色及相關(guān)機制了解甚少。通

4、過查閱文獻我們發(fā)現(xiàn)，到目前為止只有兩項動物實驗旨在研究在關(guān)節(jié)制動條件下，軟骨和軟骨下骨的變化及相互聯(lián)系。其中，在一項兔子制動模型的實驗中[23]，研究人員發(fā)現(xiàn)股骨干骺端骨密度顯著降低，而股骨軟骨總粘多糖(glycosaminoglycan)和羥脯氨酸(hydroxyproline)的水平卻直到制動3周后仍然保持不變。相反，另一項動物實驗發(fā)現(xiàn)，將犬膝關(guān)節(jié)行支具制動4周后，關(guān)節(jié)軟骨在出現(xiàn)較溫和變化的同時軟骨下骨厚度卻沒有受到明顯的影響[24

5、]。上述兩個實驗所得到的研究結(jié)論并不一致，并且它們的實驗設(shè)計本身存在缺陷，即均以單個時間點對軟骨和軟骨下骨進行評價，且均未能深刻闡明軟骨下骨在制動中對軟骨產(chǎn)生的影響及機制。
　　本研究克服了上述實驗的缺陷，將鼠膝關(guān)節(jié)分別制動1周，4周和8周，利用Micro-CT來研究軟骨和軟骨下骨在結(jié)構(gòu)上不同時間點的變化情況。我們通過對軟骨和軟骨下骨切片組織染色，在形態(tài)學上對兩者在制動條件下產(chǎn)生的變化以及它們之間的聯(lián)系進行了研究。
　　目的

6、：
　　1、探討不同時長的制動對實驗鼠膝關(guān)節(jié)軟骨下骨的影響;
　　2、探討不同時長的制動對實驗鼠膝關(guān)節(jié)軟骨的影響;
　　3、探討上述兩者變化之間的相互關(guān)系。
　　方法：
　　1、實驗動物和制動方案
　　36只成年雄性、體重介于210g至250g的Wistar大鼠被隨機均分到以下三組:(1)1周處理組(1W，n=12);(2)4周處理組(4W，n=12);及(3)8周處理組(8W，n=12)。各組隨機挑

7、選6只大鼠，并隨機選擇單側(cè)膝關(guān)節(jié)作為制動膝關(guān)節(jié)區(qū)域(immobilized knee region，IKR)，通過內(nèi)固定的方法分別固定1、4或8周，同時對側(cè)膝關(guān)節(jié)則不作處理，作為非制動膝關(guān)節(jié)區(qū)域(non-immobilized knee region，non-IKR)，各組中剩余的6只大鼠不做無任何處理，隨機取單側(cè)膝關(guān)節(jié)作為外部對照膝關(guān)節(jié)區(qū)域(external control knee region，ECKR)。
　　各組實驗鼠麻

8、醉后，將5cm長的克氏針垂直插入小鼠制動側(cè)股骨近端和脛骨遠端，克氏針兩端打結(jié)形成一個完整的閉環(huán)，并使膝關(guān)節(jié)呈150°屈曲位。手術(shù)過程中注意膝關(guān)節(jié)腔和關(guān)節(jié)軟骨不被破壞。手術(shù)后立即行X線照射確保制動效果。
　　2.標本處理
　　實驗開始和結(jié)束時為每只實驗鼠稱重，并且在經(jīng)過相應(yīng)時長的處理（制動或者非制動）后，使用0.3％戊巴比妥鈉腹腔麻醉后處死。對于每組中的制動鼠，截取出所有制動膝關(guān)節(jié)區(qū)域和非制動膝關(guān)節(jié)區(qū)域的股骨并去除軟組織，隨后

9、使用硬組織切片機(EXAKT3000 CP Band System， Norderstedt，Germany)將股骨髁部分切下。對于每組中非制動鼠，隨機選擇一側(cè)膝關(guān)節(jié)（即外部對照膝關(guān)節(jié)區(qū)域）接受同樣上述處理。每根股骨近端行Micro-CT(SkyScan1076 Micro-CTsystem， Kontich， Belgium)檢測;隨后將這些標本浸泡在pH=7.4的4％稀釋福爾馬林溶液中24小時，之后將每份樣本包埋入石蠟中，并通過10

10、％的EDTA脫鈣。最后，股骨樣本在冠狀面從內(nèi)到外被切成5μm厚的薄片。
　　3.檢測指標
　　3.1 Micro-CT檢測:所有股骨遠端均通過Micro-CT(SkyScan1076 Micro-CTsystem， Kontich， Belgium)檢測。X線管的電壓為88KV，電流為100μ A，并且配備鋁質(zhì)過濾器。掃描從股骨遠端生長板開始，向近端推進3.2mm區(qū)域為感興趣區(qū)域(region of interest，ROI

11、)。松質(zhì)骨通過分離骨皮質(zhì)獲得。測量的參數(shù)包括:骨體積分數(shù)(BV/TV，％)，骨小梁厚度(Tb.Th，mm)，骨小梁間隔(Tb.Sp，mm)，結(jié)構(gòu)模型指數(shù)(SMI)，各向異性的程度(DA)，Tb.Pf(1/mm)以及骨小梁數(shù)量(Tb.N)。軟骨下骨板的測量參數(shù)包括骨體積分數(shù)(BV/TV，％)，骨小梁厚度(Tb.Th，mm)和孔隙率(porosity，％)。
　　3.2組織形態(tài)學檢測:每個切片都經(jīng)過HE、SO以及天狼新紅染色。觀察的指

12、標包括:關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨結(jié)構(gòu)，軟骨細胞狀態(tài)，毛細血管增生情況，以及潮線等。其中，關(guān)節(jié)軟骨的平均厚度定義為在切面中點兩旁約300μ m范圍內(nèi)，從軟骨和軟骨下骨過度區(qū)域到關(guān)節(jié)軟骨表面的平均距離。關(guān)節(jié)軟骨細胞數(shù)被定義為在400μm長，100μm寬長方形內(nèi)的軟骨細胞的數(shù)量。計數(shù)時，軟骨細胞在HE染色下呈現(xiàn)藍色，并且每個不同區(qū)域都由兩名不同的研究者獨立計數(shù)并取平均值。帶有成像分析功能的尼康-H600顯微鏡被用來觀察SO染色的情況，觀察對象為被天

13、狼新紅染色的膠原蛋白的排列情況。用于觀測的顯微鏡配備有和極性光譜配對的影像分析系統(tǒng)(Olympus CCD DP71/OlympusMicroscope BX-51)。
　　結(jié)果：
　　1.Micro-CT結(jié)果
　　1.1軟骨下松質(zhì)骨的Micro-CT結(jié)果:
　　軟骨下松質(zhì)骨的Micro-CT結(jié)果可參見表2，從中可以發(fā)現(xiàn)制動膝關(guān)節(jié)區(qū)域和非制動膝關(guān)節(jié)區(qū)域的比較中，許多指標的變化是有意義的(p＜0.05)，而非制動膝

14、關(guān)節(jié)區(qū)域和外部對照膝關(guān)節(jié)區(qū)域的比較則較少發(fā)現(xiàn)顯著性差異(p＞0.05)?？偟膩碚f，關(guān)節(jié)制動會導致更低的BV/TV和Tb.Th，以及更高的Tb.Pf，并使松質(zhì)骨向柱狀轉(zhuǎn)變。更重要的是，這些變化隨著時間的推進而更加明顯。
　　1.2軟骨下骨板的Micro-CT結(jié)果:
　　a.軟骨下骨板的厚度在4周末，制動膝關(guān)節(jié)區(qū)域較非制動膝關(guān)節(jié)區(qū)域（0.109±0.011mm vs.0.138±0.018 mm，p=0.013）更薄。8周末，在

15、內(nèi)側(cè)（0.107±0.017mmvs.0.134±0.015mm，p=0.014）和外傾（0.101±0.014 mm vs.0.139±0.011 mm，p=0.000），軟骨下骨板的厚度都薄于非制動膝關(guān)節(jié)區(qū)域。
　　b.在1周末，外側(cè)的制動膝關(guān)節(jié)區(qū)域軟骨下骨板的孔隙率相比于非制動膝關(guān)節(jié)區(qū)域更高（64.6±7.2％ vs.39.9±5.9％， p=0.027）。同樣在4周末，制動膝關(guān)節(jié)的孔隙率和非制動膝關(guān)節(jié)區(qū)域相比，無論在內(nèi)側(cè)(

16、72.5±8.2％vs.42.6±7.9％，p=0.022)還是在外側(cè)（72.1±8.0％ vs.42.4±6.6％，p=0.041）都更高。在8周末，和外側(cè)非制動區(qū)域相比，內(nèi)側(cè)制動膝關(guān)節(jié)區(qū)域的孔隙率顯著增高(72.1±8.1％ vs.42.4±6.6％，p=0.024)。
　　2.形態(tài)學改變
　　2.1 HE、SO和天狼新紅染色圖片結(jié)果
　　通過HE和SO染色，我們發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨的形態(tài)和組織微結(jié)構(gòu)均發(fā)生了顯著

17、退化。HE染色下，非制動區(qū)域軟骨表面和制動區(qū)域相比更為平滑，軟骨細胞較為均勻地分布在軟骨各區(qū)域中。SO染色中，可以清晰地觀察到潮線，骨和軟骨交界區(qū)域聯(lián)系緊密，而血管侵襲至軟骨下骨板并達關(guān)節(jié)軟骨的情況則較為少見。相反，制動膝關(guān)節(jié)區(qū)域在SO染色下，軟骨表面的細胞排列變得不規(guī)則，同時細胞數(shù)量減少，并且這種變化隨著制動的持續(xù)而加劇。
　　相反，我們發(fā)現(xiàn)軟骨細胞在第1周末出現(xiàn)肥大，隨后第4、8周末出現(xiàn)萎縮。在制動膝關(guān)節(jié)區(qū)域，和軟骨層上方區(qū)域

18、相比，中間和下方區(qū)域的軟骨細胞逐漸減少，這種現(xiàn)象在血管侵襲部位周圍尤為明顯。此外，在鈣化軟骨和軟骨下骨組織中可見侵襲血管，而其周圍軟骨細胞則出現(xiàn)腫脹變化。另外，和非制動區(qū)域相比，制動膝關(guān)節(jié)區(qū)域中軟骨細胞層下的沉積線(cement line)呈不連續(xù)改變，而軟骨下骨厚度則隨制動時間增厚。
　　通過天狼星紅染色，我們發(fā)現(xiàn)隨著制動時間延長，制動膝關(guān)節(jié)區(qū)域的膠原蛋白纖維厚度逐漸降低，且在制動膝關(guān)節(jié)區(qū)域的切片中可見膠原蛋白纖維在第4周末出現(xiàn)

19、排列紊亂，并且隨著制動時間的延長膠原纖維逐漸減少并消失。
　　2.2軟骨細胞數(shù)量和關(guān)節(jié)軟骨厚度:
　　軟骨細胞數(shù)量（個）在第1、4、8周時，在外部對照膝關(guān)節(jié)區(qū)域分別為91.83±5.34、93.67±6.53、92.5±5.36，在非制動膝關(guān)節(jié)區(qū)域組分別為89.83±5.34、88.17±5.49、86.83±3.67，而在制動膝關(guān)節(jié)區(qū)域組分別為83.33±4.55、72.17±3.82、65.33±3.33。其中，制動膝關(guān)

20、節(jié)區(qū)域組中的軟骨細胞數(shù)量相較于外部對照膝關(guān)節(jié)區(qū)域在第8周是顯著減少的，相較于非制動膝關(guān)節(jié)區(qū)域組在第4周和第8周也是顯著減少的。
　　關(guān)節(jié)軟骨層的厚度(μm)在第1、4、8周時，在外部對照膝關(guān)節(jié)區(qū)域分別204.56±9.92、212.03±10.68、209.61±9.19，在非制動膝關(guān)節(jié)區(qū)域組分別為207.46±10.03、206.97±8.83、203.91±7.79，在制動膝關(guān)節(jié)區(qū)域組分別為205.28±10.48、186.4

21、3±4.43、177.53±3.09。其中，制動膝關(guān)節(jié)區(qū)域的關(guān)節(jié)軟骨層厚度在第4周和第8周時相對于非制動膝關(guān)節(jié)區(qū)域和外部對照膝關(guān)節(jié)區(qū)域均是顯著減小的。
　　結(jié)論：
　　第一部分結(jié)論
　　不同時長的制動會使軟骨下骨微結(jié)構(gòu)變得更薄、更疏松以及更脆，骨小梁向柱狀改變，并且上述退變是隨著制動時間的延長而加重的。上述結(jié)果表明制動對軟骨下骨是有消極影響的，并且可能會誘發(fā)OA和OP的發(fā)生，這為今后對這兩種疾病的預防和治療提供了新的思

22、路。
　　第二部分結(jié)論
　　制動對于關(guān)節(jié)具有消極影響，并且隨著制動時間的延長，關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨的退變程度均會加重。同時，制動誘導的軟骨下骨的退變早于關(guān)節(jié)軟骨的退變，并且是關(guān)節(jié)軟骨退變的直接原因之一。因此，對于臨床上需要較長時間制動處理的病人，均需慎重對待，并在條件允許的情況下盡快恢復功能鍛煉。另一方便，制動可能是OA的誘導因素之一，但是目前的研究還不夠完善，需要進一步的實驗研究制動在OA發(fā)病機制中的作用，這可能為今后相關(guān)疾