深圳市龍崗區(qū)部分蚊傳蟲媒病毒的分子流行病學(xué)研究.pdf

1、目的：了解深圳市龍崗區(qū)成蚊攜帶蟲媒病毒的情況,探討相關(guān)病毒株的分子流行病學(xué)特征,為蚊媒傳染病的預(yù)防與控制提供依據(jù)。
　　方法：2009~2011年,在龍崗區(qū)的龍城、南灣、坂田等10個(gè)街道及21個(gè)大運(yùn)場(chǎng)館室內(nèi)外環(huán)境設(shè)立監(jiān)測(cè)點(diǎn),按照《全國(guó)病媒生物監(jiān)測(cè)方案》監(jiān)測(cè)方法采集成蚊標(biāo)本。采用SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光RT-PCR進(jìn)行乙腦病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)、登革病毒(Dengue virus

2、,DV)和NamDinh病毒(Nam Dinh virus,NDiV)等蟲媒病毒的檢測(cè),分析成蚊病毒感染情況;用C6/36與BHK-21細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)病毒的分離工作,以TaqMan-MGB實(shí)時(shí)熒光RT-PCR與基因擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行病毒鑒定。測(cè)序基因擴(kuò)增片段,用ClustalX、Mega4、DNASTAR等軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性分析與構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。
　　結(jié)果：共采集成蚊25556只,隸屬3屬7種,分別是按蚊屬的中華按蚊、微小按蚊、嗜人

3、按蚊;庫(kù)蚊屬的三帶喙庫(kù)蚊和致倦庫(kù)蚊;伊蚊屬的東鄉(xiāng)伊蚊和白紋伊蚊。致倦庫(kù)蚊23962只,為優(yōu)勢(shì)蚊種,占93.8％;東鄉(xiāng)伊蚊637只,占2.5%;白紋伊蚊有408只,占1.6%;三帶喙庫(kù)蚊385只,占1.5%;其他種類占0.6%。
　　SYBR GreenⅡ?qū)崟r(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,有2批致倦庫(kù)蚊和1批三帶喙庫(kù)蚊標(biāo)本檢出乙腦病毒核酸陽(yáng)性,白紋伊蚊和東鄉(xiāng)伊蚊標(biāo)本各1批檢出登革病毒核酸陽(yáng)性;4批致倦庫(kù)蚊標(biāo)本檢出Nam Dinh病毒

4、核酸陽(yáng)性。
　　4批NDiV核酸陽(yáng)性標(biāo)本能引起C6/36細(xì)胞出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變(CPE),但不引起B(yǎng)HK-21細(xì)胞的病變。SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)JEV和DV核酸陽(yáng)性的標(biāo)本接種C6/36細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞后,未能分離到相關(guān)病毒。
　　用TaqMan-MGB實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)NDiV分離物中病毒核酸隨時(shí)間推延的增殖情況,檢測(cè)結(jié)果顯示0天、3天、6天、9天分離物的Ct值呈梯度減少,表明隨分離時(shí)間的增加,

5、培養(yǎng)液中病毒核酸含量同步遞增。
　　對(duì)4株深圳NDiV進(jìn)行RdRp基因和部分ZmHel1基因的擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖電泳均出現(xiàn)目的條帶。4株分離株RdRp基因核苷酸序列間同源性在99.8~100.0%之間,氨基酸序列同源性為99.7~100.0%;深圳分離株的RdRp基因核苷酸和氨基酸序列與越南代表株NDiV(02VN178)的同源性均達(dá)99%以上;系統(tǒng)進(jìn)化樹分析,深圳NDiV分離株與越南NDiV代表株的親緣性最近,同屬一個(gè)進(jìn)