深圳市軍團(tuán)菌污染現(xiàn)況及分子流行病學(xué)研究.pdf

1、本文擬對(duì)深圳市空調(diào)冷卻塔微生物污染狀況，尤其是軍團(tuán)菌污染狀況作較為全面的調(diào)查，建立流行病學(xué)資料。 目的：1.對(duì)深圳市賓館、醫(yī)院、影院、寫字樓等公共場所的空調(diào)冷卻塔水進(jìn)行軍團(tuán)菌的分離培養(yǎng)，了解軍團(tuán)菌的污染狀況。檢測細(xì)菌總數(shù)、大腸菌群、糞大腸菌群，初步了解空調(diào)冷卻塔微生物污染狀況以及軍團(tuán)菌與它們之間是否存在一定聯(lián)系。2.對(duì)所采集的冷卻塔水進(jìn)行PCR檢測，并與常規(guī)分離培養(yǎng)方法進(jìn)行比較。3.用AFLP技術(shù)對(duì)常規(guī)分離培養(yǎng)出的菌株進(jìn)行分子生

2、物學(xué)分型，分析分離菌株的多態(tài)性，確定菌株的遺傳基礎(chǔ)之間相互的聯(lián)系和變異，了解深圳市軍團(tuán)菌分布流行病學(xué)特征。 方法：1.采用平皿計(jì)數(shù)法對(duì)中央空調(diào)冷卻塔水進(jìn)行軍團(tuán)菌的分離培養(yǎng)，用血清學(xué)方法對(duì)分離菌株進(jìn)行初步鑒定。2.檢測冷卻塔水中pH值以及細(xì)菌總數(shù)、大腸菌群以及糞大腸菌群，了解其與軍團(tuán)菌檢出之間是否存在一定聯(lián)系。3.分別用兩種引物，一種是軍團(tuán)菌屬特異性引物5srRNA，另一種是嗜肺軍團(tuán)菌巨噬細(xì)胞感染力增強(qiáng)因子基因(mip)對(duì)冷卻塔水

3、中軍團(tuán)菌進(jìn)行PCR方法確證。確定兩種引物檢出軍團(tuán)菌的靈敏度。將PCR方法與常規(guī)分離培養(yǎng)進(jìn)行對(duì)校，探討兩種方法在檢測軍團(tuán)菌時(shí)的利弊。4.采用AFLP基因分型技術(shù)(按照TheEuropeanWorkingGroupforLegionellaInfections標(biāo)準(zhǔn))[2]對(duì)所分離菌株進(jìn)行分子分型。測定DNA在260nm、280nm處的吸光度值，計(jì)算DNA濃度。分析AFLP圖譜，探討在整個(gè)調(diào)查中的優(yōu)勢菌種。并用Bionumerics軟件對(duì)圖譜

4、進(jìn)行聚類分析，觀察菌株之間的相似度。 結(jié)果：1.在所調(diào)查的55家賓館、商場、醫(yī)院等公共場所中，有31家存在軍團(tuán)菌污染，污染率為56.4％。在所采集的103份冷卻塔水樣中，有53份檢出軍團(tuán)菌，陽性率為51.5％。2.用常規(guī)分離培養(yǎng)方法共分離到67株軍團(tuán)菌。用血清學(xué)方法檢查，嗜肺軍團(tuán)菌53株，非嗜肺14株。3.PCR方法中兩種引物檢測軍團(tuán)菌的靈敏度分別為5srRNA為＞1.05×108cfu/mL，mip＞1.05×103cfu/m

5、L。4.采用常規(guī)分離培養(yǎng)方法與PCR方法對(duì)冷卻塔水進(jìn)行檢測，比較兩者的陽性檢出率。結(jié)果表明PCR方法有較高的檢出率，103份冷卻塔水，PCR方法檢出率為94.2％；而常規(guī)培養(yǎng)方法的檢出率為51.5％。5.采用AFLP基因分型技術(shù)對(duì)分離到菌株進(jìn)行分子分型，lp1型共分離到8種不同的AFLP圖譜，分別記為AFLP1-8，其中AFLP1型與AFLP5型為主要型別。lp2-14型共分離到7種AFLP圖譜分別記為AFLPⅠ-AFLPⅦ，其中AFL

6、PⅢ為主要型別。非嗜肺的型別分布不集中說明有不同種的非嗜肺型菌存在。5.應(yīng)用Bionemerics軟件對(duì)圖譜進(jìn)行分析，根據(jù)相似系數(shù)，將菌株分為10群，各菌間相似系數(shù)集中在70％-100％之間。 結(jié)論：本研究在深圳市各公共場所內(nèi)，獲得了冷卻塔水中軍團(tuán)菌的流行病學(xué)資料，為比較研究提供了可靠數(shù)據(jù)，對(duì)軍團(tuán)菌進(jìn)行了分子分型，可以了解菌株的遺傳基礎(chǔ)之間相互的聯(lián)系和變異。為制訂深圳市軍團(tuán)菌的監(jiān)測防治措施和控制該病的爆發(fā)流行提供科學(xué)依據(jù)。