成骨片調(diào)節(jié)microRNA在激素性股骨頭缺血壞死差異表達的初步研究.pdf

1、目的:
　　1.探討中藥袁氏生脈成骨片治療激素性股骨頭缺血壞死(Steroid-inducedOsteonecrosis of Femoral Head SONFH)的臨床療效。
　　2.探索microRNA在SONFH患者外周血中的差異表達，分析差異表達的microRNA可能的調(diào)控作用。
　　3.尋找中藥干預(yù)SONFH兔模型中microRNA的差異表達，分析中藥調(diào)控microRNA表達治療SONFH可能的機理。

2、>　　方法:
　　1.觀察26例SONFH患者口服袁氏生脈成骨片每日3次，每次6粒，共服3個月，記錄并比較SONFH患者服用藥物前、服藥1個月、服藥2個月和服藥3個月患側(cè)髖關(guān)節(jié)Harris評分、VAS評分，收集數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。評價服用袁氏生脈成骨片對SONFH患者髖關(guān)節(jié)Harris評分、VAS評分的影響。
　　2.選取2014年7月～2015年2月廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)科門診就診的ARCOⅡ期SONFH患者6例（

3、觀察組）及同期廣州中醫(yī)藥大學(xué)在校健康志愿者6例作為對照組。采集兩組研究對象血漿，采用microRNA Real-time PCR芯片篩選差異表達的microRNA。根據(jù)TargetScan、mirBase及miRanda三個數(shù)據(jù)庫預(yù)測差異表達microRNA的靶基因并進行生物信息學(xué)分析。
　　3.選取普通級健康成年新西蘭兔，體重2.5～3.0kg，雌雄各半，共30只。以隨機數(shù)字表法分為中藥組、對照組和空白組，各10只。中藥組和對照

4、組每只每日以內(nèi)毒素10ug/kg為總量，經(jīng)耳緣靜脈分2次進行注射，共注射2日，于第3次注射內(nèi)毒素時以甲強龍40mg/kg行臀肌注射，而后每間隔24h以甲強龍40mg/kg注射1次，共注射甲強龍3次。空白組于相同時間點注射等量生理鹽水，注射期間各組兔均臀肌注射青霉素4萬單位/只，預(yù)防感染。中藥組于最后一次注射甲強龍時以袁氏生脈成骨片0.4片/kg灌胃，對照組及空白組以相同計量生理鹽水灌胃，灌胃8周。于造模4周時，中藥組與對照組各隨機選取1

5、只兔，取股骨頭樣品行HE染色，觀察造模成功與否。灌胃完成后收集兔血漿采用高通量測序法測定其microNRA相對表達量，篩選出觀察組、對照組較空白組差異表達的microRNA，獲取此調(diào)控途徑中的關(guān)鍵microRNA進行生物信息學(xué)分析。
　　結(jié)果:
　　1.口服袁氏生脈成骨片前、服藥1個月、服藥2個月、服藥3個月患側(cè)髖關(guān)節(jié)Harris評分分別為38.17±4.02，39.83±3.97、42.67±2.25和44.33±3.20

6、，患側(cè)髖關(guān)節(jié)VAS評分分別為6.83±0.41、6.33±0.52、5.00±0.89和4.33±0.52，服藥前與服藥2、3個月相比較均具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　2.SONFH患者血漿中采用microRNA Real-time PCR芯片檢測752個microRNA，兩組差異表達的microRNA18個，其中觀察組上調(diào)13個，下調(diào)5個。共篩選出交集靶基因887個。GO分析顯示，觀察組較對照組差異表達microRNA調(diào)控的靶基因功能主

7、要包括解剖結(jié)構(gòu)形態(tài)、間充質(zhì)細胞增殖、細胞的代謝過程等，Pathway分析顯示靶基因明顯富集于多條信號通路。
　　3.在SONFH兔模型實驗中采用miRDeep2.0進行microRNA預(yù)測，共預(yù)測出887個可能microRNA。對照組與空白組之間存在差異表達的microRNA，經(jīng)同源性分析篩選出與之對應(yīng)的人類microRNA:hsa-miR-941和hsa-miR-187。并且hsa-miR-941和hsa-miR-187表達量在

8、空白組、對照組和中藥組間呈現(xiàn)先升高再回落的表達趨勢。hsa-miR-187可調(diào)控細胞凋亡和血管生成。MAPK信號通路在中藥組與空白組差異表達的microRNA靶基因中富集明顯。
　　結(jié)論:
　　1.袁氏生脈成骨片可有效改善ARCOⅡ期SONFH患者患側(cè)髖關(guān)節(jié)Harris評分和VAS評分。
　　2.本研究發(fā)現(xiàn)SONFH患者血漿中microRNA較正常人出現(xiàn)差異表達，說明這些差異表達的microRNA可能作為篩選SONFH