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文檔簡介
1、目的:
1.觀察白楊素急性給藥是否可以減輕H2O2所致的HUVEC氧化應(yīng)激損傷;
2.觀察白楊素是否可以減輕高糖導(dǎo)致的HUVEC損傷和改善高糖損傷的大鼠離體主動脈舒張反應(yīng)性。
方法:
1.(1)培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC),用H2O2(100~1000μM)處理2 h,通過MTT實驗及細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH的檢測,觀察不同濃度H2O2對細(xì)胞活力及膜
穩(wěn)定性的影響,選取最適濃度作為造模濃
2、度;常規(guī)培養(yǎng)HUVEC細(xì)胞,分為正常對照組(control)、H2O2損傷組(H2O2)及不同濃度白楊素處理組(25μM、50μM、100μM),檢測各組細(xì)胞活力以及細(xì)胞膜穩(wěn)定性;(2)測定各組HUVEC細(xì)胞內(nèi)丙二醛(MDA)濃度和超氧化物歧化酶(SOD)活性;(3)用10μM DCEF-DA孵育HUVEC30 min,熒光顯微鏡拍照分析各組細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(ROS)的量;(4)采用Griess法檢測各組細(xì)胞內(nèi)一氧化氮(NO)的釋放;(5
3、)采用比色法檢測各組HUVEC細(xì)胞內(nèi)一氧化氮合酶(NOS)活性;(6)采用RT-PCR法檢測各組HUVEC細(xì)胞粘附分子ICAM-1、VCAM-1的mRNA水平;(7)采用Western Blot法檢測各組HUVEC細(xì)胞eNOS蛋白表達(dá)水平。
2.(1)培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC),通過MTT實驗觀察不同濃度葡萄糖(11.1 mM、22.2 mM、33.3 mM、44.4 mM)對HUVEC細(xì)胞活力的影響并選擇適當(dāng)濃度時間
4、建立高糖損傷模型;培養(yǎng)HUVEC細(xì)胞,分為正常糖濃度組(normal glucose, NG)、高糖組(high glucose, HG)、甘露醇對照組(mannitol, MNT)、白楊素干預(yù)組(25μM、50μM、100μM),檢測各組細(xì)胞活力;DCEF-DA預(yù)孵30 min,熒光顯微鏡拍照分析各組活性氧簇(ROS)量;通過Griess法檢測各組細(xì)胞內(nèi)皮釋放NO的功能;采用比色法測定各組HUVEC細(xì)胞內(nèi)NOS活性;(2)采用大鼠離體
5、主動脈血管環(huán),通過檢測ACh誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)性觀察高濃度葡萄糖對血管內(nèi)皮的損傷作用以及白楊素的干預(yù)作用。
結(jié)果:
1.不同濃度的H2O2(100~1000μM)處理2 h后,隨著H2O2濃度的升高HUVEC細(xì)胞存活率逐漸降低。當(dāng)濃度達(dá)400μM時,細(xì)胞存活率為(65.73±4.06)%,與control組相比有顯著性差異(P<0.01);
2.不同濃度白楊素(25μM、50μM、100μM)預(yù)處理1
6、2 h后,細(xì)胞存活率分別增至(71.94±4.68)%、(82.17±4.65)%、(86.24±3.44)%,在50μM、100μM時與H2O2損傷組相比具有顯著性差異(P<0.01);
3. H2O2處理2 h后,細(xì)胞內(nèi)MDA含量升高,濃度為(8.23±0.09)μM;而SOD活力顯著降低,活性為(0.59±0.07)U/mgprot,與 control組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);白楊素(25μM、50μM、100
7、μM)預(yù)處理12 h后,MDA含量顯著降低,分別降至(7.91±0.09)μM、(7.65±0.16)μM、(7.63±0.18)μM,與H2O2損傷組相比有顯著性差異(P<0.01);SOD活性與H2O2損傷組相比顯著升高,并且在濃度為50μM、100μM時有顯著性差異(P<0.01),分別為(0.79±0.06)U/mgprot和(1.37±0.04)U/mgprot;
4. H2O2處理2 h后,細(xì)胞內(nèi)ROS生成增多,而
8、不同濃度白楊素(25μM、50μM、100μM)預(yù)處理12 h后,與H2O2損傷組相比,ROS產(chǎn)生減少;
5. H2O2處理2 h后,細(xì)胞內(nèi)NO釋放量顯著降低,濃度為(9.09±0.55)μM,與control組相比有顯著性差異(P<0.01);白楊素(25μM、50μM、100μM)預(yù)處理12 h后,NO釋放量與H2O2損傷組相比增加,并且在50μM、100μM時,有顯著性差異(P<0.01),釋放量分別為(10.97±0.
9、65)μM、(11.43±0.85)μM;
6. HUVEC細(xì)胞在H2O2處理2 h后,胞內(nèi)總一氧化氮合酶(TNOS)和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性同時降低,活力分別為(0.81±0.01)U/mgprot、(0.05±0.05) U/mgprot;而誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(iNOS)活性升高,活力為(0.82±0.16)U/mgprot,與control組相比具有顯著性差異(P<0.01);而白楊素(25μM、50μM、1
10、00μM)預(yù)處理12 h后,胞內(nèi)總一氧化氮合酶(TNOS)活性升高,活力分別增至(0.97±0.10) U/mgprot、(1.09±0.12)U/mgprot和(1.12±0.13)U/mgprot,內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性同時升高,活力分別為(0.20±0.09)U/mgprot、(0.38±0.12)U/mgprot和(0.41±0.13)U/mgprot,而誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(iNOS)活性降低,活力分別為(0.84±
11、0.09)U/mgprot、(0.70±0.10)U/mgprot和(0.71±0.03)U/mgprot,與H2O2
損傷組相比具有顯著性差異(P<0.01);
7. RT-PCR檢測結(jié)果顯示,H2O2損傷2小時,HUVEC細(xì)胞黏附分子VCAM-1、ICAM-1的 mRNA增加,不同濃度白楊素預(yù)孵育12 h,HUVEC細(xì)胞內(nèi)粘附分子VCAM-1、ICAM-1的mRNA表達(dá)降低;
8. Western bl
12、ot實驗結(jié)果顯示,H2O2損傷2小時,HUVEC細(xì)胞eNOS蛋白表達(dá)量下降,不同濃度白楊素預(yù)處理HUVEC細(xì)胞12 h后,eNOS蛋白表達(dá)量增加,與H2O2損傷組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);
9.高糖(HG,glucose33.3 mM)孵育48 h后,細(xì)胞存活率降為(82.56±3.97)%,與 NG組相比有顯著性差異(P<0.01);而甘露醇對照組(MNT, glucose5.5mM+mannitol27.8 mM)
13、與NG組相比無顯著性差異;白楊素(25μM、50μM、100μM)預(yù)處理2 h后,細(xì)胞存活率顯著升高,分別為(103.40±4.78)%、(107.60±11.58)%和(121.80±7.40)%,與HG損傷組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01);
10.高糖(HG,glucose33.3 mM)孵育48 h后,胞內(nèi)ROS增多,而白楊素(25μM、50μM、100μM)預(yù)處理2 h后,胞內(nèi)ROS減少;
11.高糖(HG
14、,glucose33.3 mM)孵育后,細(xì)胞內(nèi)NO含量降至(2.63±0.38)μM,與NG組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);而甘露醇對照組(MNT, glucose5.5 mM+mannitol27.8 mM)與NG組相比無顯著性差異;不同濃度白楊素預(yù)處理2 h后,胞內(nèi) NO含量增加,在濃度為50μM、100μM時與 HG損傷組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05),分別為(4.03±0.69)μM、(4.07±0.98)μM;
15、 12. HUVEC細(xì)胞在高糖(HG,glucose33.3 mM)孵育48 h后,胞內(nèi)總一氧化氮合酶(TNOS)和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性同時降低,活性為(1.10±0.07) U/mgprot、(0.01±0.18)U/mgprot;而誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(iNOS)活性升高,活性為(1.10±0.23)U/mgprot,與NG組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);MNT組與NG相比沒有顯著性差異;白楊素(25μM、50μM
16、、100μM)預(yù)處理后,胞內(nèi)總一氧化氮合酶(TNOS)活性升高,活性分別為(1.35±0.31)U/mgprot、(1.66±0.38) U/mgprot和(1.71±0.25)U/mgprot;內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性同時升高,活性分別為(0.22±0.58)U/mgprot、(0.70±0.25)U/mgprot和(1.03±0.37)U/mgprot;而誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)活性降低,活性分別為(1.13±0.2
17、9)U/mgprot、(0.96±0.13)U/mgprot和(0.69±0.15)U/mgprot;與 HG損傷組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異
?。≒<0.05);
13.大鼠離體主動脈血管環(huán)在高糖(HG, glucose44.4 mM)孵育4 h后,ACh誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性舒張功能減弱,Emax和EC50為(31.78±3.36)%,81.10μM,與NG組相比有顯著性差異(P<0.01);而 SNP誘導(dǎo)的非內(nèi)皮依賴性舒張與
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