APE1在氧化應激介導肺血管內(nèi)皮細胞損傷中的調(diào)控作用.pdf

1、目的:
　　本研究從細胞水平上觀察H2O2對肺血管內(nèi)皮細胞的損傷作用和APE1表達的影響;了解APE1表達上調(diào)后對肺血管內(nèi)皮細胞損傷細胞的影響，從反面論證APE1在氧化應激誘導肺血管內(nèi)皮細胞損傷過程中的是否有調(diào)控作用。
　　方法:
　　(1)體外分離培養(yǎng)鼠肺血管內(nèi)皮細胞，在含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中調(diào)整細胞濃度為1×105/ml后培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板，以不同濃度H2O2刺激培養(yǎng)細胞，不同時間點檢測ROS的產(chǎn)生、細

2、胞增殖情況以及APE1的表達;
　　(2)然后構建攜帶APE1基因的慢病毒載體體外轉染肺血管內(nèi)皮細胞，上調(diào)APE1的表達，觀察APE1表達上調(diào)后對H2O2介導肺血管內(nèi)皮細胞ROS產(chǎn)生及細胞增殖反應的影響。
　　結果:
　　一、H2O2對肺血管內(nèi)皮細胞增殖反應、ROS產(chǎn)生以及APE1表達的影響
　　(1) MTT法結果顯示與對照組相比，H2O2濃度為50umol/L刺激內(nèi)皮細胞24h，OD值為0.211±0.002

3、，肺血管內(nèi)皮細胞增殖反應無明顯改變，P＞0.05，差異無顯著意義，當H2O2濃度為100umol/L，200umol/L，OD值分別為0.158±0.002，0.099±0.001，肺血管內(nèi)皮細胞增殖反應低下(P＜0.05)，且200umol/L的H2O2比100umol/L抑制細胞的增殖反應更明顯(P＜0.05);而采用DCF平均熒光強度值表示細胞內(nèi)ROS的生成，當H2O2濃度為50umol/L，熒光強度為68.07±1.40，與對照

4、組比較無明顯差異(P＞0.05)，當濃度為100umol/L，200umol/L，熒光強度分別為87.46±1.89，101.79±1.56，呈上升趨勢(P＜0.05)，且200umol/L比100umol/L的H2O2引起細胞產(chǎn)生ROS增多更加明顯(P＜0.05)。用100umol/L H2O2刺激肺血管內(nèi)皮細胞24h、48h、96h，OD值分別為0.161±0.002，0.103±0.001，0.067±0.004，與對照組比較，細

5、胞的增殖反應低下(P＜0.05)，而48h的細胞增殖反應比24h有下降(P＜0.05)，96h比48h細胞增殖反應低下，P＜0.05有統(tǒng)計學意義;與此同時，細胞內(nèi)ROS的生成，測得的DCF熒光強度分別為82.33±0.72，93.93±0.30，102.93±0.95，呈上升趨勢(P＜0.05)，而胞內(nèi)生成的ROS在48h較24h增加(P＜0.05)，96h生成的ROS比48h增多，P＜0.05，有統(tǒng)計學意義，呈時效、量效關系。

6、　　(2)與對照組相比，隨著濃度的增加及刺激時間的延長，Western blot檢測APE1蛋白的表達受抑制(P＜0.05)，同樣具有時效、量效關系。
　　二、APE1對H2O2介導肺血管內(nèi)皮細胞損傷的調(diào)節(jié)作用
　　(1)與對照組及空載體組相比，Western blot檢測結果提示，攜帶APE1基因的慢病毒載體體外轉染肺血管內(nèi)皮細胞，能夠上調(diào)APE1的表達(P＜0.05);
　　(2)與對照組相比較，H2O2組ROS（

7、熒光強度為86.40±1.19）產(chǎn)生顯著增加(P＜0.05)、增殖反應（OD值為0.153±0.001）下降(P＜0.05);與H2O2組比較，H2O2+LV-GFP組ROS生成（熒光強度為83.23±0.98）及增殖能力（OD值0.154±0.002）無顯著改變，APE1過表達后，肺血管內(nèi)皮細胞增殖反應（OD值為0.209±0.001）抑制情況顯著改善(P＜0.05)，而ROS生成（熒光強度為66.79±1.32）顯著降低(P＜0.0