紅車軸草總黃酮對氧化應激誘導的血管內(nèi)皮細胞和心肌細胞損傷的保護作用及機制研究.pdf

1、缺血性心臟病（又稱冠心病，Coronary Artery Disease）的發(fā)病率和致死率逐年增高，已成為威脅人類健康的重大疾病之一。近年來其發(fā)病年齡逐漸有年輕化的趨勢，因而引起了廣泛的關(guān)注。
　　 動脈粥樣硬化是誘發(fā)冠心病的始動因素，血管內(nèi)皮細胞損傷是導致動脈粥樣硬化的關(guān)鍵因素。心肌細胞壞死是冠心病的晚期病理特征，心肌細胞損傷是導致心肌細胞壞死的重要因素。因而，內(nèi)皮細胞和心肌細胞損傷是導致冠心病發(fā)生發(fā)展的重要病理因素。大量研究

2、表明，氧化應激是導致內(nèi)皮細胞和心肌細胞損傷的主要原因。氧化應激是指部分還原形態(tài)的氧離子即活性氧自由基(Reactive Oxygen Species，ROS)的生成超過了細胞內(nèi)源性解毒和/或使用能力的非穩(wěn)定狀態(tài)，體內(nèi)過多的氧自由基將作用于蛋白質(zhì)、核酸、脂類等生物大分子，并直接或間接地激活細胞內(nèi)的多條信號轉(zhuǎn)導通路來調(diào)節(jié)基因的表達，造成細胞結(jié)構(gòu)和功能受損，最終導致細胞死亡。因而尋找具有抗氧化應激作用的化合物對于冠心病的預防和治療都具有重要的

3、臨床意義。
　　 具有抗氧化作用的黃酮類化合物是治療和預防心血管疾病中草藥的主要有效成分，研究發(fā)現(xiàn)紅車軸草富含黃酮類成分，且紅車軸草總黃酮(Red Clover Flavonoids,RCF)具有抗氧化作用，大量研究表明其在預防和治療心血管疾病中具有潛在應用價值。而且，紅車軸草來源廣泛、價格低廉，具有明顯的新藥研發(fā)優(yōu)勢。但目前關(guān)于紅車軸草總黃酮對氧化應激誘導的血管內(nèi)皮細胞和心肌細胞損傷的保護作用及作用機制均鮮有報道。因而本實驗一

4、方面采用體外細胞培養(yǎng)，建立以H2O2為刺激因素的氧化應激損傷模型，探究紅車軸草總黃酮對H2O2誘導的心肌細胞和內(nèi)皮細胞損傷的保護作用，并探討其初步作用機制;另一方面采用異丙腎上腺素(Isoprotenenol，ISO)誘導大鼠急性心肌缺血模型，探討紅車軸草總黃酮對異丙腎上腺素誘導的大鼠急性心肌缺血的保護作用及作用機制，以期為開發(fā)紅車軸草總黃酮治療缺血性心臟病提供實驗依據(jù)。
　　 本課題分為三個部分:
　　 第一部分紅車軸

5、草總黃酮對過氧化氫誘導的血管內(nèi)皮細胞損傷的保護作用
　　 實驗目的:研究紅車軸草總黃酮對過氧化氫誘導的血管內(nèi)皮細胞損傷的保護作用，并進一步探究其作用機制。
　　 實驗方法:利用體外培養(yǎng)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞ECV-304，采用H2O2誘導細胞損傷模型，觀察紅車軸草總黃酮對H2O2所致的血管內(nèi)皮細胞損傷的保護作用。MTT法檢測細胞存活率、試劑盒測定細胞中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化酶(GS

6、H-Px)活性及細胞中丙二醛(MDA)的含量、乳酸脫氫酶(LDH)的漏出量;分光光度計法檢測Caspase-3的活性;Hoechst33342及PI熒光染色法觀察紅車軸草總黃酮對H2O2誘導血管內(nèi)皮細胞凋亡的影響;JC-1染色法檢測紅車軸草總黃酮對H2O2誘導血管內(nèi)皮細胞線粒體膜電位的影響，檢測各組細胞內(nèi)ROS的表達水平。
　　 實驗結(jié)果:與空白對照組相比，模型組血管內(nèi)皮細胞存活率降低、細胞內(nèi)LDH漏出量顯著增加(P＜0.001

7、);抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px活性顯著降低、MDA含量顯著升高(P＜0.01)、Caspase-3活性升高（P＜0.001）、ROS含量升高、線粒體膜電位降低;與模型組相比，紅車軸草總黃酮各劑量組(12.5、25、50μg/mL)及槲皮素組(30μg/mL)細胞存活率明顯增加（P＜0.01，P＜0.05），紅車軸草總黃酮各劑量組(12.5、25、50μg/mL)及槲皮素組（30μg/mL）均能顯著降低LDH漏出量(P＜0.01

8、，P＜0.05)、明顯增強SOD、CAT及GSH-Px活力（P＜0.01，P＜0.05）、降低MDA、ROS含量及Caspase-3活性(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001)、升高線粒體膜電位(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:紅車軸草總黃酮對H2O2誘導的血管內(nèi)皮細胞損傷有明顯的保護作用，其初步作用機制可能與抗自由基、減輕脂質(zhì)過氧化、降低Caspase-3活性及穩(wěn)定線粒體膜電位有關(guān)。
　　 第二部分紅車軸草總黃酮對

9、過氧化氫誘導的心肌細胞H9c2損傷的保護作用
　　 實驗目的:研究紅車軸草總黃酮對過氧化氫(H2O2)誘導的心肌細胞損傷的保護作用，并進一步探究其作用機制。
　　 實驗方法:采用H9c2心肌細胞細胞系，建立H2O2損傷模型，培養(yǎng)24 h后隨機分為空白對照組、模型組、紅車軸草總黃酮組(25、50、100μg/mL)及槲皮素組(20μg/mL)，各給藥組預孵育6h后進行H2O2損傷造模。觀察紅車軸草總黃酮對H2O2誘導的心肌

10、細胞損傷的保護作用的量效、時效關(guān)系，采用MTT法檢測細胞活力，試劑盒檢測乳酸脫氫酶(LDH)的漏出量、丙二醛(MDA)的含量、過氧化氫酶(CAT)及超氧化物歧化酶(SOD)活力。H33342及PI熒光染色法檢測細胞凋亡。檢測各組細胞中促凋亡蛋白Bax、抗凋亡蛋白Bcl-2、MAPK家族（JNK、ERK、P38）及其磷酸化形式(p-JNK、p-ERK、p-P38)等蛋白的蛋白表達水平。
　　 實驗結(jié)果:與空白對照組相比，模型組心肌

11、細胞存活率降低、細胞內(nèi)LDH漏出量增加、SOD活性降低、MDA含量升高、CAT活性降低(P＜0.001)、細胞內(nèi)促凋亡蛋白Bax表達水平升高、MAPK家族的磷酸化形式(p-JNK、p-ERK、p-P38)表達水平升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平下降;與模型組相比，預孵育6h后，紅車軸草總黃酮各處理組（50、100.μg/mL）細胞存活率明顯增加(P＜0.001)，紅車軸草總黃酮各處理組及槲皮素組均能非常明顯降低LDH漏出量(P＜0.0

12、01)、明顯增強SOD和CAT活力、降低MDA含量(P＜0.01)，細胞內(nèi)Bax表達水平下降，MAPK家族的磷酸化形式(p-JNK、p-ERK、p-P38)表達水平下降，Bcl-2表達水平升高。
　　 結(jié)論:紅車軸草總黃酮對H2O2誘導的心肌細胞損傷有明顯的保護作用，其初步作用機制可能與抗自由基、減輕脂質(zhì)過氧化作用、下調(diào)Bax表達、上調(diào)Bcl-2表達及調(diào)節(jié)MAPK家族相關(guān)蛋白的磷酸化等有關(guān)。
　　 第三部分紅車軸草總黃酮

13、對異丙腎上腺素誘導的大鼠急性心肌缺血的保護作用
　　 實驗目的:探討紅車軸草總黃酮對異丙腎上腺素誘導的大鼠急性心肌缺血的保護作用及其作用機制。
　　 實驗方法:探討紅車軸草總黃酮對異丙腎上腺素誘導的大鼠急性心肌缺血的保護作用。將紅車軸草總黃酮按高、中、低(200、100、50 mg/kg)三個劑量對SD大鼠進行灌胃給藥15天，于給藥第14、15天大鼠皮下注射異丙腎上腺素(4 mg/kg，s.c.)，給藥結(jié)束后腹主動脈取血

14、，檢測血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶(CK)的水平;4％多聚甲醛灌注后對心臟行HE染色;檢測心臟組織中丙二醛(MDA)含量，超氧化物歧化酶(SOD)、總抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽還原酶(GR)的活力及過氧化物酶(POD)、活性氧自由基(ROS)的水平。
　　 實驗結(jié)果:與空白對照組相比;異丙腎上腺素模型組血清中;AST、CK、LDH水平顯著升高(P＜0.01

15、)，心臟組織中SOD、T-AOC、GR、GSH-Px、POD活力顯著降低(P＜0.01)，MDA和ROS含量顯著升高(P＜0.01);而給予紅車軸草總黃酮后，可顯著抑制血清中AST、CK、LDH水平的升高，顯著抑制心臟組織中SOD、T-AOC、GR、GSH-Px、POD活力的降低(P＜0.01)，對心肌細胞有良好的保護作用。
　　 結(jié)論:紅車軸草總黃酮對異丙腎上腺素誘導的大鼠急性心肌缺血有明顯的保護作用，其初步作用機制可能與抗自