B7-1人-鼠嵌合抗體對Pristane誘導的小鼠狼瘡樣腎炎模型的免疫干預效應及分子機制的研究.pdf

1、B7-1（又稱CD80）分子是一種共刺激分子，主要表達于抗原提呈細胞（antigen presenting cell，APC）表面，其受體為T淋巴細胞表面CD28家族分子，二者結合后可介導 T細胞活化、增殖與分化，從而發(fā)揮機體的免疫效應。正常生理條件下B7-1分子表達穩(wěn)定，為T細胞的活化提供協(xié)同刺激信號，維持T細胞的存活。當B7-1不表達或低表達的時候，將會導致T細胞的功能異常，致使T細胞無能或凋亡，導致機體患病。反之B7-1高表達又會

2、使T細胞過度活化，引起自身免疫性疾病。
　　自身免疫性疾病（autoimmune disease，AID）是指機體對自身抗原發(fā)生免疫反應而導致自身組織損害所引起的疾病，主要表現(xiàn)為T、B淋巴細胞過度活化。系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種常見的自身免疫病，其中狼瘡性腎炎又是SLE最常見和最嚴重的并發(fā)癥，是導致SLE患者死亡的主要原因之一。大量研究表明，在 SLE患者體內 B7-1

3、分子的表達明顯高于正常人，提示B7-1/CD28協(xié)同刺激信號在SLE病理過程中發(fā)揮著重要作用。
　　通過B7-1抗體封閉抗原提呈細胞表面的B7-1分子，從而阻斷B7-1/CD28信號通路，降低機體的免疫應答。但傳統(tǒng)的單克隆抗體由于鼠源性高，易引起人抗鼠抗體反應（human anti-mouse antibody response，HAMA），限制了其應用。采用基因工程技術設計的嵌合抗體是一種人源化的重組抗體，它是應用DNA重組技術

4、將鼠源性單抗V區(qū)基因與人IgG的C區(qū)基因拼接后，插入適當載體，轉染相應宿主細胞表達的抗體分子。嵌合抗體包含了鼠源Fab段與人源Fc段，人源化部分達到70％，大大降低了HAMA反應，延長了半衰期。此類抗體一方面具有鼠源性單抗 Fab段高親和力結合抗原的能力，另一方面其人源 Fc段在患者體內又可介導ADCC效應、CDC效應及免疫調理作用。
　　本課題在運用化學法建立小鼠狼瘡樣腎炎模型并對其進行生物學鑒定的基礎上，運用自行研制的B7-1

5、人鼠嵌合抗體對模型小鼠進行干預，通過免疫學、血清學、病理學等指標，探討B(tài)7-1人鼠嵌合抗體阻斷B7-1/CD28信號通路對小鼠狼瘡樣腎炎模型病理損傷的逆轉效應，以期尋找針對該類疾病更加高效、安全、給藥方便的抗體藥物。
　　一、B7-1人鼠嵌合抗體的制備及鑒定
　　目的：制備 B7-1人鼠嵌合抗體并對其生物學特性進行鑒定。
　　方法：將表達B7-1嵌合抗體的細胞株大規(guī)模培養(yǎng)，收集上清；Protein G親和層析分離純化抗

6、體；流式細胞術分析嵌合抗體對人及小鼠細胞膜型B7-1分子的識別。
　　結果：經(jīng)Protein G親和層析柱分析純化，Lowry法定量，所得的嵌合抗體蛋白濃度為2.5mg/L；B7-1人鼠嵌合抗體與轉人B7-1基因小鼠成纖維細胞株L929-B7-1、淋巴瘤細胞株Daudi、小鼠脾臟細胞的識別率分別為95.1%，96.6%和51.7%。
　　結論：B7-1人鼠嵌合抗體能夠特異性的識別細胞膜表面B7-1分子。
　　二、化學法

7、建立小鼠狼瘡樣腎炎模型并對其進行生物學鑒定
　　目的：在運用化學法建立小鼠狼瘡樣腎炎模型，并通過免疫學、血清學、組織形態(tài)學等指標對其進行生物學鑒定。
　　方法：取6周齡雌性C57BL/6J小鼠，隨機分為2組，模型組予一次性腹腔注射Pristane0.5ml/只，空白對照組給予等體積的生理鹽水。每2周檢測一次血清中ANA及抗dsDNA抗體的滴度，每月定期檢測小鼠的尿蛋白含量，流式細胞術分析脾臟中抗原提呈細胞、漿細胞、T細胞的活

8、化程度，經(jīng)HE染色觀察腎臟的病理學改變，免疫組織化學分析腎臟免疫復合物的沉積，透射電鏡觀察腎小球及基底膜的改變。
　　結果：Pristane誘導后，部分小鼠出現(xiàn)尿蛋白，隨時間的延長，4個月時80%小鼠尿蛋白含量達到++~+++；2個月時，小鼠血清中抗dsDNA抗體陽性率為60%，ANA陽性率為90%；流式分析結果顯示，模型組小鼠脾臟中吞噬細胞、樹突狀細胞、粒細胞的活化明顯升高（P＜0.05），B細胞膜表面CD21、CD80、CD8

9、6分子表達水平造模組明顯高于對照組（P＜0.05），模型組T細胞表面CD4、CD25、CD28、CD152分子表達明顯高于對照組（P＜0.05）；腎臟HE切片可見腎小球體積中重度增大，大量炎性細胞浸潤及腎小管輕微充血，免疫熒光染色可見腎小球上有大量IC沉積；透射電鏡觀察腎小球致密物沉積明顯，基底膜嚴重增厚。
　　結論：成功建立Pristane誘導的小鼠狼瘡樣腎炎模型。
　　三、B7-1人-鼠嵌合抗體對小鼠狼瘡樣腎炎模型的免疫

10、干預效應及分子機制的研究
　　目的：探討B(tài)7-1人-鼠嵌合抗體阻斷B7/D28信號通路對小鼠狼瘡樣腎炎模型病理損傷的逆轉效應。
　　方法：按上述方法建立小鼠狼瘡樣腎炎模型，取成模小鼠隨機分為3組，每組10只?？贵w干預組用B7-1人-鼠嵌合抗體經(jīng)眼眶后靜脈給藥，陽性對照組注射免疫抑制劑 CTX，模型組注射人同型 IgG。每月定期檢測尿蛋白含量、血清中ANA及抗dsDNA抗體滴度，干預至3個月時，處死小鼠，研磨脾臟經(jīng)流式細胞術分

11、析多種免疫相關細胞的活化，取腎臟進行HE染色分析，免疫復合物（IC）檢測及透射電鏡觀察。
　　結果：抗體干預后，尿蛋白濃度逐漸由++~+++降為±~++，同時血清中ANA和抗dsDNA抗體的熒光強度也明顯降低，與模型組比較具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。流式結果顯示，抗體干預組脾臟中吞噬細胞、樹突狀細胞、粒細胞的活化明顯低于模型組（P＜0.05），B細胞膜表面CD80、CD86分子表達水平模型組明顯高于抗體干預組（P＜0.05），

12、T細胞表面CD4、CD25、CD152分子表達情況模型組高于抗體干預組，有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；腎臟HE染色結果顯示，抗體干預組腎小球炎性細胞侵潤及腎小管充血等表現(xiàn)均得到明顯改善。免疫熒光染色可見抗體干預組抗原抗體復合物（IC）的熒光強度明顯減弱。經(jīng)透射電鏡觀察，抗體干預組與模型組相比，腎小球上的電子致密物沉積減少，基底膜厚度趨于均勻。
　　結論：B7-1人鼠嵌合抗體通過抑制B7-1/CD28信號通路下調機體的免疫應答，減少