B7-1雙價(jià)抗體對(duì)Pristane所致小鼠狼瘡樣腎炎的免疫干預(yù)效應(yīng)及分子機(jī)制的研究.pdf

1、B7-1分子是表達(dá)于抗原遞呈細(xì)胞(antigen presenting cell，APC)表面的重要共刺激分子，其受體是表達(dá)于T細(xì)胞表面的CD28。B7-1分子與CD28結(jié)合轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞活化的正性共刺激信號(hào)。該信號(hào)具有促進(jìn)抗原特異性T細(xì)胞增殖，分泌細(xì)胞因子，誘導(dǎo)效應(yīng)T細(xì)胞分化及防止T細(xì)胞發(fā)生凋亡等功能。
　　系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)是具有自身反應(yīng)性的T、B淋巴細(xì)胞異?；罨?，產(chǎn)

2、生自身抗體及免疫復(fù)合物等特點(diǎn)的自身免疫性疾病(autoimmune disease,AID)。該病變累及全身，可造成多器官和組織的慢性病變和功能喪失。其中尤其以狼瘡性腎炎(lupus nephritis,LN)為最嚴(yán)重的并發(fā)癥，且是導(dǎo)致SLE患者死亡的主要原因。研究發(fā)現(xiàn)，B7-1/CD28信號(hào)通路在SLE疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，因此阻斷B7-1/CD28信號(hào)通路為自身免疫性疾病SLE的干預(yù)提供了理論依據(jù)。
　　本課題1.

3、運(yùn)用本室自行構(gòu)建的能夠持續(xù)穩(wěn)定分泌鼠抗人 B7-1雙價(jià)抗體的基因工程細(xì)胞株SAШ制備并純化雙價(jià)抗體。2.根據(jù)自身免疫性疾病SLE的病理?yè)p傷機(jī)制，運(yùn)用Pristane化學(xué)法誘導(dǎo)與人類SLE相似的C57BL/6小鼠狼瘡樣腎炎模型并進(jìn)行鑒定。3.應(yīng)用鼠抗人B7-1雙價(jià)抗體對(duì)該疾病模型進(jìn)行免疫干預(yù)效應(yīng)及其分子機(jī)制的研究。尋找此類疾病治療的新靶標(biāo)及新手段。
　　一、鼠抗人B7-1雙價(jià)抗體的制備及生物學(xué)鑒定
　　目的：制備鼠抗人 B7-

4、1雙價(jià)抗體并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定。
　　方法：采用體外細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)收集CHO細(xì)胞的培養(yǎng)上清，經(jīng)離心及超濾等預(yù)處理，上Profinity TM IMAC鎳柱進(jìn)行純化；流式細(xì)胞術(shù)分析B7-1雙價(jià)抗體對(duì)細(xì)胞膜型B7-1的識(shí)別；變性及非變性條件SDS凝膠電泳對(duì)該雙價(jià)抗體的雙價(jià)性進(jìn)行鑒定。
　　結(jié)果：上清中抗體蛋白的得率為10mg/L；該抗體與轉(zhuǎn)人B7-1基因的L929細(xì)胞、人的B淋巴瘤細(xì)胞Raji及人的T淋巴瘤細(xì)胞Jurke

5、t的結(jié)合率分別為99.3％、97.9％及9.5％；該抗體在變性及非變性條件SDS凝膠電泳得到了27 kDa及53 kDa的目的蛋白條帶。
　　結(jié)論：成功制備了鼠抗人B7-1雙價(jià)抗體。
　　二、Pristane誘導(dǎo)小鼠狼瘡樣腎炎模型的建立及生物學(xué)鑒定
　　目的：構(gòu)建pristane所致小鼠狼瘡樣腎炎模型并對(duì)該模型進(jìn)行生物學(xué)鑒定。
　　方法：將8周齡雌性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為2組，造模組與陰性對(duì)照組分別10只，造

6、模組予一次性腹腔注射降植烷0.5mL/只，陰性對(duì)照組予一次性腹腔注射生理鹽水0.5mL/只，造模時(shí)間為4個(gè)月。4個(gè)月時(shí)，Albustix尿蛋白試紙檢測(cè)小鼠尿蛋白含量；間接免疫熒光法檢測(cè)血清中抗雙鏈 DNA(ds-DNA)抗體及抗核抗體（ANA)含量；流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠脾臟中APC、T細(xì)胞及B細(xì)胞的百分率；直接免疫熒光法檢測(cè)腎小球免疫復(fù)合物(immunity complex,IC)沉積；HE染色觀察腎小球病理改變；透射電鏡觀察腎小球超微結(jié)

7、構(gòu)變化。
　　結(jié)果：建模4個(gè)月時(shí)，小鼠均出現(xiàn)蛋白尿，蛋白嚴(yán)重程度為+~++，尿蛋白含量為300 mg/L~1000 mg/L；小鼠血清中均可檢測(cè)到熒光強(qiáng)度較強(qiáng)的抗dsDNA抗體和ANA；小鼠脾臟中的APC、T細(xì)胞及B細(xì)胞的活化水平顯著高于對(duì)照組(p<0.05)；小鼠腎小球系膜上IC沉積嚴(yán)重；HE染色結(jié)果顯示，小鼠腎小球增大、腎小球囊腔不規(guī)則改變及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)嚴(yán)重；透射電鏡可見腎小球基底膜增厚，腎小球基底膜處有尖銳轉(zhuǎn)角，臟層細(xì)胞及基

8、底膜間可見大量免疫復(fù)合物沉積。
　　結(jié)論：成功建立pristane誘導(dǎo)的小鼠狼瘡樣腎炎模型。
　　三、B7-1雙價(jià)抗體對(duì)小鼠狼瘡樣腎炎的免疫干預(yù)效應(yīng)及分子機(jī)制研究
　　目的：應(yīng)用鼠抗人B7-1雙價(jià)抗體阻斷或削弱 B7/CD28信號(hào)通路，對(duì)pristane所致C57BL/6小鼠狼瘡樣腎炎模型的免疫干預(yù)效應(yīng)及可能的分子機(jī)制進(jìn)行研究。
　　方法：按第二部分的方法建模，取雌性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為4組，每組5只。對(duì)照

9、組：參照抗體組同一時(shí)間給予等量的生理鹽水；造模組：參照抗體組同一時(shí)間給予等劑量的小鼠 IgG同型對(duì)照；抗體組：設(shè)首次注射時(shí)間為第1天，于第1、3、5、8、15、43、71、99天分別尾靜脈注射鼠抗人 B7-1雙價(jià)抗體10mg/kgw/只；CTX組：設(shè)首次注射時(shí)間為第1天，于第1、8、22、29、43、50、64、71、85、92天分別腹部注射CTX60mg/kgw/只。Albustix尿蛋白試紙檢測(cè)小鼠尿蛋白含量；間接免疫熒光法檢測(cè)血清

10、中抗ds-DNA抗體及ANA含量；流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠脾臟中APC、T細(xì)胞及B細(xì)胞的百分率；HE染色觀察腎小球病理改變；直接免疫熒光法檢測(cè)腎小球免疫復(fù)合物(IC)沉積；透射電鏡觀察腎小球超微結(jié)構(gòu)變化。
　　結(jié)果：抗體組小鼠尿蛋白含量較造模組顯著降低；抗體組小鼠血清中抗 dsDNA抗體和 ANA的熒光強(qiáng)度較造模組明顯減弱；抗體組小鼠脾臟中的APC、T細(xì)胞及B細(xì)胞的活化水平顯著低于造模組(p<0.05)；抗體組小鼠HE染色結(jié)果顯示，腎小

11、球增大、腎小球囊腔不規(guī)則改變及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況明顯減輕；抗體組小鼠腎小球系膜上IC沉積明顯減輕；抗體組小鼠透射電鏡可見腎小球基底膜增厚明顯減輕，臟層細(xì)胞及基底膜間IC沉積明顯減少。
　　結(jié)論：B7-1雙價(jià)抗體通過阻斷或削弱B7/CD28信號(hào)可降低T、B細(xì)胞的異?；罨?，減少自身抗體的產(chǎn)生，從而減輕免疫復(fù)合物對(duì)腎功能的損傷。因此 B7-1雙價(jià)抗體的免疫干預(yù)可逆轉(zhuǎn)pristane所誘導(dǎo)的小鼠狼瘡樣腎炎的病理?yè)p傷，提示該抗體對(duì)SLE疾病的