硫化氫對糖尿病大鼠心肌氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的拮抗作用.pdf

1、研究背景與目的：
　　糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DC）是一種特異性心肌病，可能涉及代謝紊亂、心肌纖維化、心臟自主神經(jīng)病變、氧化應(yīng)激、心肌凋亡等多種因素，但其具體機(jī)制尚未闡明。線粒體在細(xì)胞凋亡過程中扮演者重要的角色?；钚匝酰≧OS）的過度累積等促細(xì)胞凋亡因子作用于線粒體后，促使線粒體內(nèi)外膜電位和通透性的改變，導(dǎo)致線粒體內(nèi)凋亡執(zhí)行因子釋放進(jìn)入胞質(zhì)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。但線粒體在細(xì)胞凋亡過程中的具體的作用機(jī)

2、制仍不明確，有待進(jìn)一步探索。故深入對線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑的探討與研究，將為DC的認(rèn)識與治療提供新的思路和手段，為新藥物的研究提供更多的作用靶點(diǎn)。硫化氫（Hydrogen sulfide，H2S）是繼一氧化氮（Nitric oxide，NO）和一氧化碳（Carbonic oxide，CO）之后發(fā)現(xiàn)的又一種新的氣體信號分子，近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性 H2S對心肌細(xì)胞有多種保護(hù)作用，如抗氧化、抗凋亡、抗炎，而H2S改善DC的作用及

3、其內(nèi)在機(jī)制，目前研究和了解很少，因此探討H2S對糖尿病(Diabetes mellitus，DM)心肌損害的影響對尋找DC新的治療途徑有重要意義。為此，本研究通過建立STZ誘導(dǎo)DM大鼠模型，探討H2S對DC的影響及其機(jī)制。
　　方法：
　　成年雄性SD(Sprague-Dawley，SD)大鼠，隨機(jī)分為5組：對照組(Control)；DM模型組(STZ)；低濃度保護(hù)組(C1)；高濃度保護(hù)組(C2)；H2S對照組（H2S）。然

4、后對STZ組、C1組和C2組大鼠腹腔注射(Intraperitoneal injection，ip)鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)(40 mg/kg)建立DM模型。STZ注射后的72h，尾靜脈采血測空腹血糖，高于16.7 mmol/L，認(rèn)為DM模型成功建立。對C1組(30μmol/kg)、C2組(100μmol/kg)和H2S組(100μmol/kg)使用相應(yīng)濃度硫氫化鈉(Sodium hydrosulfide,Na

5、HS)溶液腹腔注射作為H2S供體。實(shí)驗(yàn)8周后取大鼠心臟組織，Western blotting法檢測各組心肌組織H2S生成酶胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-gamma-lyase，CSE)、巰基丙酮酸轉(zhuǎn)硫酶(mercaptopyruvate sulfurtransferase，MPST)以及凋亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase-3、Bcl-2的表達(dá)；用蘇木精伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色觀察心肌

6、病理變化；堿水解法檢測羥脯氨酸表達(dá)水平；透射電鏡觀察線粒體結(jié)構(gòu)；Elisa法檢測心肌組織中 MDA、4-HNE和GSH的含量；NBT法檢測SOD含量；TUNEL染色觀察了各組心肌凋亡。
　　結(jié)果：
　　1.成功建立DM大鼠模型。STZ注射72 h后檢測血糖，結(jié)果顯示血糖明顯升高，且每只大鼠血糖均高于16.7 mmol/L。
　　2.H2S對DM大鼠體重（Body weight，BW）、心臟重量（Heart weight

7、，HW）、心臟體重比（HW/BW）的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后DM大鼠 BW和HW明顯輕于對照組，HW/BW值明顯高于對照組，提示DM大鼠心臟出現(xiàn)肥大，H2S對DM大鼠BW，HW及HW/BW并無影響。
　　3.H2S可上調(diào)DM大鼠H2S生成酶的表達(dá)。Western blotting法檢測的結(jié)果：DM大鼠心臟組織中H2S生成酶CSE及MPST的表達(dá)明顯下降，而H2S可上調(diào)DM大鼠CSE及MPST的表達(dá)。
　　4.H2S可改善DM大鼠心臟

8、重構(gòu)。HE染色結(jié)果：DM大鼠心臟膠原排列紊亂、松散，心肌纖維間隙增寬，而 H2S可以改善 DM大鼠心肌病理變化。堿水解法結(jié)果：羥脯氨酸在DM大鼠心臟組織中的表達(dá)明顯高于對照組。而 H2S減少了DM大鼠心臟組織中羥脯氨酸的表達(dá)。
　　5.H2S可減輕DM大鼠心肌細(xì)胞的線粒體病變。透射電鏡結(jié)果顯示：DM大鼠心肌線粒體水腫空泡化的比例較對照組明顯上升，而H2S干預(yù)的DM大鼠心臟組織中線粒體水腫空泡化的比例下降。
　　6.H2S可減

9、輕DM大鼠心肌氧化應(yīng)激。Elisa檢測結(jié)果：DM大鼠心臟組織中MDA和4-HNE的表達(dá)較對照組明顯升高，GSH的表達(dá)較對照組明顯下降。而H2S明顯抑制了DM大鼠心臟組織中MDA和4-HNE的表達(dá)，增加了DM大鼠心臟組織中 GSH的表達(dá)。而 NBT法檢測結(jié)果：SOD在DM大鼠心臟組織中表達(dá)下降，而H2S干預(yù)下可以改善SOD的表達(dá)。
　　7.H2S可改善DM大鼠心肌凋亡。Western blotting檢測結(jié)果：DM大鼠心臟組織Cle

10、aved Caspase-3的表達(dá)較對照組明顯升高，Bcl-2的表達(dá)較對照組明顯降低。而 H2S明顯抑制了DM大鼠心臟組織中Cleaved Caspase-3的的表達(dá)，增加了DM大鼠心臟組織中Bcl-2的表達(dá)。Tunel染色檢測結(jié)果：DM大鼠心臟組織中凋亡細(xì)胞數(shù)量較對照組明顯增加，而H2S可減少DM大鼠心肌細(xì)胞的凋亡。
　　結(jié)論：
　　1.DM大鼠心臟組織中內(nèi)源性H2S生成減少，同時伴隨氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡的增加。