酪酸梭菌對(duì)炎癥性腸病小鼠腸黏膜屏障保護(hù)機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　炎癥性腸?。↖BD）的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。最近的研究認(rèn)為，IBD的發(fā)病可能與腸粘膜屏障破壞有關(guān)。IBD在治療方面多采用類(lèi)固醇激素、免疫抑制劑及5-氨基水楊酸(5-ASA)類(lèi)藥物，但此類(lèi)藥物不良反應(yīng)較多且療效不佳。微生態(tài)制劑酪酸梭菌在治療IBD動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人類(lèi)UC中均取得了良好的療效，分析其機(jī)制可能與益生菌參與腸道粘膜屏障的保護(hù)作用有關(guān)。
　　隨著微生物學(xué)的發(fā)展，應(yīng)用益生菌(probiotics)治療或輔助治療IB

2、D已成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。酪酸梭菌屬于梭菌屬的革蘭陽(yáng)性專(zhuān)性厭氧芽胞桿菌，臨床實(shí)踐證明酪酸梭菌在治療腸道疾病方面的效果顯著，然而其確切的作用機(jī)制尚不十分清楚。為明確酪酸梭菌對(duì)腸黏膜屏障是否具有保護(hù)作用及其機(jī)制，本研究應(yīng)用葡聚糖硫酸鈉(DSS)建立IBD動(dòng)物模型，觀(guān)察酪酸梭菌對(duì)腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白（Claudin-1、Claudin-2、occludin和ZO-1）表達(dá)的影響，為酪酸梭菌用于IBD的治療提供理論基礎(chǔ)。
　　方法：

3、r>　　1、DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型的建立與分組
　　50只BALB/c小鼠隨機(jī)分為正常組、DSS模型組、酪酸梭菌組、5-ASA組、酪酸梭菌聯(lián)合5-ASA組，每組10只。正常組自由飲水7天，其余四組給予5％DSS自由飲用7天。正常組不予干預(yù)，模型組每日給予相應(yīng)藥物灌胃。
　　2、疾病活動(dòng)指數(shù)積分(DAI)
　　每日稱(chēng)量小鼠體重、觀(guān)察大便性質(zhì)和行隱血試驗(yàn)，按Hamamoto等標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行DAI積分。
　　3、組織學(xué)損傷積

4、分
　　應(yīng)用HE染色觀(guān)察小鼠結(jié)腸粘膜的改變。按照Dielemen積分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)損傷積分。每個(gè)切片隨機(jī)選取5個(gè)以上高倍視野(X200)，取平均值作為組織學(xué)損傷積分。
　　4、腸道細(xì)菌培養(yǎng)
　　在無(wú)菌操作下，分別采取從大鼠肛門(mén)擠出的新鮮大便，接種到選擇性培養(yǎng)基平板上，需氧菌在37℃培養(yǎng)48h，厭氧菌在37℃培養(yǎng)72h，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)(cfu/g)。大腸桿菌，雙歧桿菌，乳桿菌，腸球菌的培養(yǎng)分別用EMB，BBL，MRS，ES

5、培養(yǎng)基。
　　5、免疫組化法檢測(cè)緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin、Claudin-2和ZO-1的表達(dá)
　　石蠟包埋塊4μm連續(xù)切片，應(yīng)用免疫組化SP法檢測(cè)Claudin-1、Occludin、Claudin-2和ZO-1的表達(dá)，進(jìn)行顯微鏡下觀(guān)察染色的效果，顯微鏡下(×400)攝片。
　　6、Western blot法檢測(cè)緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin、Claudin-2和ZO-1的表達(dá)

6、以及炎癥因子IL-1β、IL-13、IL-10、TNF-α和NF-κB的表達(dá)
　　分別取正常組，DSS造模第3天組，DSS造模第7天組，5-ASA組，酪酸梭菌組以及S-ASA聯(lián)合酪酸梭菌組小鼠中下1/3結(jié)腸組織，以Western blot法檢測(cè)Claudin-1、Occludin、Claudin-2和ZO-1的表達(dá)以及炎癥因子IL-1β、IL-13、IL-10、TNF-α和NF-κB的表達(dá)。
　　7、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　本

7、實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用SPSS17.0分析軟件，采用ANOVE方差分析法中SNK和LSD法進(jìn)行差異性分析，P＜0.05提示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、酪酸梭菌對(duì)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)及組織學(xué)損傷的影響
　　正常組小鼠一般情況良好，疾病活動(dòng)指數(shù)積分(DAI)在零水平左右;其余4組小鼠在造模第3天出現(xiàn)體質(zhì)量減輕，毛發(fā)無(wú)光澤，活動(dòng)減少，精神萎靡，黏液便，部分小鼠大便尖端有膿等，DAI積分開(kāi)始

8、升高，并在第7天達(dá)到最高;給予5-ASA、酪酸梭菌和5-ASA聯(lián)合酪酸梭菌治療后，DAI積分從第5天起較DSS組有所改善(P＜0.05)，但各治療組(5-ASA組、酪酸梭菌組和5-ASA聯(lián)合酪酸梭菌組)之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。肉眼大體組織學(xué)觀(guān)察顯示結(jié)腸炎癥改變從肛門(mén)向上呈連續(xù)性發(fā)展，黏膜可見(jiàn)散在淺潰瘍，多位于左半結(jié)腸和直腸。
　　光鏡下正常組小鼠結(jié)腸黏膜完整，腺體排列整齊，隱窩正常，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和杯狀細(xì)胞減少;DSS組黏膜缺損，上皮缺

9、失，腺體大多數(shù)不完整，排列紊亂，隱窩破壞變形，廣泛炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，主要累及黏膜層，杯狀細(xì)胞明顯減少，組織學(xué)損傷積分較正常組明顯升高，差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);各治療組（酪酸梭菌組、5-ASA組和酪酸梭菌聯(lián)合5-ASA組）黏膜缺損較DSS組輕，部分腺體不完整，炎癥細(xì)胞減少，組織學(xué)損傷積分與DSS組相比下降，差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);治療組中，組織學(xué)損傷積分分別為：5-ASA聯(lián)合酪酸梭菌組高于5-ASA組高于酪酸梭菌組

10、，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，(P＜0.05)。
　　透射電鏡下觀(guān)察，正常組中緊密連接結(jié)構(gòu)位于腸上皮細(xì)胞間頂端，為一致密的發(fā)箍樣結(jié)構(gòu)，給予DSS造模第3天，即可見(jiàn)緊密連接(TJ)結(jié)構(gòu)模糊，造模7天后TJ出現(xiàn)不同程度的囊狀擴(kuò)張，數(shù)目減少，位于TJ下方的縫隙連接增寬，而給予治療后TJ結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)，密度增加。
　　2、酪酸梭菌對(duì)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠腸道菌群的影響
　　給予5-ASA，酪酸梭菌和5-ASA聯(lián)合酪酸梭菌治療后，大腸桿菌

11、、雙歧桿菌無(wú)明顯增加(P＞0.05)，而乳桿菌明顯增加(P＜0.01)，腸球菌較DSS組下降(P＜0.01)。提示酪酸梭菌有促進(jìn)腸道內(nèi)益生菌生長(zhǎng)的作用。
　　3、免疫組化法檢測(cè)酪酸梭菌對(duì)緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin、Claudin-2和ZO-1表達(dá)的影響
　　Claudin-1，Claduin-2、occludin和ZO-1均在管腔上皮細(xì)胞和隱窩上皮細(xì)胞膜及上皮細(xì)胞連接處頂端表達(dá)，呈柵欄樣，組化染色可見(jiàn)棕

12、褐色顆粒沉積。Claudin-1在DSS造模第3天表達(dá)下降，在DSS造模第7天與正常組相比棕黃色顆粒明顯減少，(P＜0.05);給予5-ASA、酪酸梭菌及5-ASA聯(lián)合酪酸梭菌治療后，表達(dá)較DSS造模第7天組增加，(P＜0.05)。Claudin-2在正常組中表達(dá)較少，給予DSS造模后第3天管腔上皮細(xì)胞和隱窩上皮細(xì)胞胞膜可見(jiàn)棕黃色顆粒沉積，DSS造模第7天(與正常組相比，P＞0.05)，棕黃色顆粒較正常組明顯增多(與正常組相比，P＜0.

13、05)，5-ASA組和酪酸梭菌組Claudin-2的表達(dá)較DSS造模第7天組無(wú)明顯下降(P＞0.05)，但聯(lián)合用藥組蛋白表達(dá)下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Occludin在正常組和造模第3天組均有表達(dá)，造模第7天occludin的表達(dá)明顯減少(P＜0.05)，5-ASA組、酪酸梭菌組和5-ASA聯(lián)合酪酸梭菌組occludin表達(dá)較DSS造模第7天組增加(P＜0.05)，且聯(lián)合用藥組occludin出現(xiàn)異位表達(dá)，即在管腔上皮細(xì)

14、胞和隱窩上皮細(xì)胞胞膜和胞漿中均有表達(dá)。ZO-1主要在管腔上皮細(xì)胞和隱窩上皮細(xì)胞胞膜表達(dá)，胞漿中亦有少量表達(dá)，給予DSS造模第3天，ZO-1的表達(dá)明顯下降，至DSS造模第7天ZO-1極少表達(dá)(P＜0.01)，5-ASA組、酪酸梭菌組和5-ASA聯(lián)合酪酸梭菌組表達(dá)明顯增加(P＜0.05)。
　　4、Western blot法檢測(cè)酪酸梭菌對(duì)Claudin-1，Claudin-2，occludin和ZO-1的影響
　　Claudin

15、-1在DSS造模第3天表達(dá)下降，在DSS造模第7天與正常組相比表達(dá)減少，(P＜0.05);給予5-ASA、酪酸梭菌及5-ASA聯(lián)合酪酸梭菌治療后，表達(dá)較DSS造模第7天組增加，(P＜0.05)。Claudin-2在正常組中表達(dá)較少，給予DSS造模后第3天表達(dá)增加，DSS造模第7天呈高表達(dá)，5-ASA組和酪酸梭菌組蛋白表達(dá)較DSS造模第7天組無(wú)明顯下降，但聯(lián)合用藥組蛋白表達(dá)下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);Occludin在正常組

16、和造模第3天組均有表達(dá)，造模第7天occludin的表達(dá)明顯減少(P＜0.05)，5-ASA組、酪酸梭菌組和5-ASA聯(lián)合酪酸梭菌組occludin表達(dá)較DSS造模第7天組增加(P＜0.05)。DSS造模第3天，ZO-1的表達(dá)下降，至DSS造模第7天ZO-1表達(dá)明顯下降(P＜0.01)，5-ASA組、酪酸梭菌組和5-ASA聯(lián)合酪酸梭菌組表達(dá)明顯增加(P＜0.05)。
　　5、酪酸梭菌對(duì)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中細(xì)胞因子IL-

17、1β、IL-10、IL-13和TNF-α以及核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB表達(dá)的影響
　　給予DSS第7天，細(xì)胞因子IL-1β、IL-13、TNF-α和NF-κB較正常組均明顯升高(P＜0.01)，而IL-10則較正常組明顯下降(P＜0.01)。給予5-ASA，酪酸梭菌和5-ASA聯(lián)合酪酸梭菌治療后，IL-1β、IL-13、TNF-α和NF-κB均較DSS組明顯下降(P＜0.01)，而IL-10較DSS組升高(P＜0.05)。
　　結(jié)

18、論：
　　1、酪酸梭菌可以緩解DSS誘導(dǎo)的炎癥性腸病小鼠急性期癥狀，修復(fù)結(jié)腸黏膜損傷。
　　2、酪酸梭菌可能通過(guò)增加緊密連接蛋白Claudin-1、occludin和ZO-1的表達(dá)，抑制腸道內(nèi)炎癥因子IL-1β、IL-13、TNF-α以及核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的表達(dá)，促進(jìn)具有抗炎癥作用的細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)，增加腸道內(nèi)乳桿菌的生長(zhǎng)，抑制腸球菌的生長(zhǎng)，從而起到調(diào)節(jié)腸道菌群的作用。
　　3、酪酸梭菌聯(lián)合5-ASA治療不但