腸三葉因子對小鼠炎癥性腸病保護(hù)作用機(jī)制的研究.pdf

1、炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)為一類病因尚未完全明確的累及胃腸道的慢性非特異性炎癥，一般指克羅恩病(Crohn disease，CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)。IBD首次發(fā)作可見于任何年齡，但20歲以下潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病患兒占炎癥性腸病總數(shù)的25％—30％。近十幾年的研究發(fā)現(xiàn)，IBD在我國的發(fā)病率也逐年增高，約為0.32/100000。因此，IBD在我國

2、也是一種較常見的消化系統(tǒng)疾病。 IBD的腸道炎癥和黏膜組織損傷是其主要特征。炎癥性腸病的病因和發(fā)病機(jī)制不明確，目前研究認(rèn)為IBD是由基因的易感性，環(huán)境因素激發(fā)和腸道免疫系統(tǒng)失調(diào)等多種因素交互作用引起的消化系統(tǒng)自身免疫性慢性炎癥疾病。 IBD的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制被認(rèn)為是感染、毒素及藥物等作為始動(dòng)因素破壞腸上皮屏障，使腸組織暴露于大量抗原中，誘發(fā)遺傳易感宿主的粘膜免疫反應(yīng)。在IBD腸道炎癥和粘膜免疫損傷的發(fā)生發(fā)展中各種炎癥細(xì)

3、胞及細(xì)胞因子(如TNF-α)、粘附分子、炎癥介質(zhì)等活性分子起著重要作用，它們參與粘膜炎癥的多種免疫反應(yīng)，并作為免疫調(diào)節(jié)的中心環(huán)節(jié)，在IBD中的作用為越來越多的研究所證明。通過特異性阻斷這些炎癥細(xì)胞和活性分子的產(chǎn)生、調(diào)控以及作用，下調(diào)免疫應(yīng)答的強(qiáng)度，從而控制炎癥、持續(xù)緩解病情已被視為研究熱點(diǎn)。 TLR(Toll—like receptor，TLR)是近年發(fā)現(xiàn)的一種免疫受體，能識(shí)別病原微生物及其細(xì)胞壁上的一些保守成分——病原相關(guān)分

4、子模式(Pathogen—associated molecular pattern，PAMP)，對腸黏膜天然免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)發(fā)揮關(guān)鍵作用。IBD患者結(jié)腸粘膜上皮細(xì)胞及固有層細(xì)胞TLR4大量表達(dá)，激活下游的細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，募集炎性細(xì)胞，釋放自由基，損傷黏膜，激發(fā)先天性免疫反應(yīng)。 炎癥性腸病(IBD)的病理表現(xiàn)在于腸道粘膜糜爛或潰瘍形成，上皮細(xì)胞廣泛的缺失和固有層內(nèi)的炎癥細(xì)胞浸潤改變。關(guān)于IBD病理機(jī)制目前雖不完全清楚，但一般認(rèn)為IB

5、D的發(fā)生與上皮細(xì)胞破壞和凋亡加速、炎性細(xì)胞凋亡減慢有著密切關(guān)系。細(xì)胞凋亡失調(diào)可以導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生。越來越多的證據(jù)顯示細(xì)胞凋亡失調(diào)對炎癥性腸病(IBD)的組織損傷和免疫功能紊亂有著重要的影響。 腸三葉因子(ITF)屬于三葉肽家族，是一種新型的生長因子類多肽物質(zhì)，具有重要的胃腸道黏膜保護(hù)和修復(fù)作用。實(shí)驗(yàn)證明ITF在維持腸上皮細(xì)胞的完整性，恢復(fù)腸粘膜的正常通透性方面起到重要作用。但現(xiàn)在很多證據(jù)把TFFs，特別是ITF與免疫調(diào)節(jié)

6、聯(lián)系在一起。更有實(shí)驗(yàn)證實(shí)ITF可以調(diào)節(jié)壞死性小腸結(jié)腸炎幼鼠模型的免疫反應(yīng)。近年來的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)ITF在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡方面也具有一定作用，這意味著ITF在IBD的治療上可能具有更多的價(jià)值。但外源性給予基因重組ITF是否可以對IBD模型小鼠起到保護(hù)作用？其機(jī)制是否與免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞凋亡干預(yù)有關(guān)？這些問題的回答也為臨床應(yīng)用ITF治療IBD提供理論依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)材料及方法： 一、動(dòng)物模型及分組 健康6—8周齡雌性BALB/C小鼠

7、，重量20-26克，由中國醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為3組，每組16只(保證每組小鼠每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取材時(shí)8只以上)。根據(jù)灌腸藥物及腹腔注射藥物的不同將BALB/C小鼠分為3組：A組：三硝基苯磺酸(TNBS)組(直腸灌注5％TNBS0.10ml/只+50％乙醇溶液0.10ml/只+灌腸后第2天起腹腔注射生理鹽水0.1ml/只，連續(xù)5天)；B組：腸三葉因子(ITF)組(直腸灌注5％TNBS0.10ml/只+50％乙醇溶液0.10ml/

8、只+灌腸后第2天起腹腔注射ITF0.1ml/只，連續(xù)5天)；C組：乙醇對照組(直腸灌注50％乙醇溶液0.20ml/只+灌腸后第2天起腹腔注射腸生理鹽水0.1ml/只，連續(xù)5天)； 灌腸后第7、14天斷頭處死動(dòng)物，留取脾及結(jié)腸標(biāo)本。實(shí)驗(yàn)過程中死亡動(dòng)物不列入本研究。 二、實(shí)驗(yàn)標(biāo)本采集及處理 造模后每天觀察動(dòng)物一般狀況、糞便情況及稱量體重；在造模后的第7天和第14天收集糞便測定大便隱血分?jǐn)?shù)，進(jìn)行疾病活動(dòng)度指數(shù)(DAI)

9、評分。同時(shí)給予10％水合氯醛0.3ml/kg腹腔注射麻醉，處死，按以下方法處理和保存標(biāo)本： 1、留取距肛門4cm左右的結(jié)腸組織約0.5cm，分別經(jīng)4％多聚甲醛溶液和2.5％戊二醛溶液固定，分別行H—E染色病理組織學(xué)計(jì)分、免疫組化、原位末端標(biāo)記法(TUNEL)凋亡檢測和透射電鏡觀察。 2、取結(jié)腸病變部位組織用濾紙吸干水分，稱重，制成組織勻漿，測結(jié)腸組織髓過氧化物酶(MPO)活性； 3、留取結(jié)腸組織0.5—1cm，置

10、于去RNA酶的Eppendorf管中，經(jīng)液氮后轉(zhuǎn)至—70℃冰箱，用于進(jìn)行Real time quantitative RT-PCR、Western blot研究。 4、取結(jié)腸組織0.5—1cm，經(jīng)液氮后轉(zhuǎn)至—70℃冰箱中，用于Western印跡實(shí)驗(yàn)。 5、留取小鼠脾及腸系膜淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞用于流式細(xì)胞儀檢測。 三、試驗(yàn)方法及檢測指標(biāo) 1、動(dòng)態(tài)觀察小鼠一般狀態(tài)、體重和排便情況。 2、病理形態(tài)學(xué)研究

11、 (1)各組動(dòng)物于各時(shí)間點(diǎn)處死后，剖開腹腔，觀察腸管顏色、有無水腫、出血、擴(kuò)張、透壁潰瘍及粘連。 (2)光鏡觀察：結(jié)腸組織常規(guī)固定后，H—E染色，光鏡下觀察結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)改變。 (3)電鏡觀察：結(jié)腸組織固定后，常規(guī)作透射電鏡觀察結(jié)腸組織超微結(jié)構(gòu)和腸絨毛的變化。 3、組織化學(xué)方法檢測結(jié)腸組織MPO的含量。 4、免疫組化法檢測結(jié)腸組織TNF-α、 TLR4、NF—κBp65蛋白的表達(dá)。 5、TUN

12、EL檢測結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡。 6、Real time quantitive RT-PCR法檢測結(jié)腸組織TLR4、NF—κBP65、Bcl—2及Bax mRNA表達(dá)。 7、Western Blotting法測定腸組織TLR4和NF—κBP65蛋白表達(dá)。 8、流式細(xì)胞術(shù)檢測脾及腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞的凋亡情況及Fas、Bcl—2表達(dá)。 四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 計(jì)量資料結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示，差異比較用SPS

13、S13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間比較采用t檢驗(yàn)法及制作統(tǒng)計(jì)圖，P<0.05提示有顯著性差異。 結(jié)論： 1、ITF可以減輕TNBS誘導(dǎo)的小鼠炎癥性腸病腸粘膜炎癥病理損傷并能促進(jìn)損傷的修復(fù)。 2、針對由TNBS誘導(dǎo)的小鼠炎癥性腸病腹腔注射ITF是一個(gè)方便而且有效的實(shí)驗(yàn)研究方法。 3、TNBS誘導(dǎo)的IBD小鼠結(jié)腸粘膜組織中TLR4/NF—κBp65的mRNA及蛋白表達(dá)上調(diào)，TNF-α高表達(dá)。 4、腹腔注

14、射ITF對小鼠炎癥性腸病結(jié)腸組織損傷的保護(hù)作用機(jī)制之一可能是與下調(diào)結(jié)腸粘膜組織中TLR4/NF—κBp65的mRNA及蛋白表達(dá)量而降低TNF-α的表達(dá)有關(guān)。 5、TNBS誘導(dǎo)的IBD小鼠結(jié)腸粘膜上皮存在凋亡過度，可能與Bcl—2 mRNA表達(dá)下調(diào)，Bax mRNA表達(dá)上調(diào)，Bcl—2/Bax的比值下降有關(guān)。 6、ITF具有下調(diào)TNBS誘導(dǎo)的IBD小鼠結(jié)腸粘膜上皮凋亡的作用，可能是通過上調(diào)Bcl—2 mRNA表達(dá)，下調(diào)Ba