Leigh綜合征等疾病中易發(fā)的PDHE1α突變體結(jié)構(gòu)、功能與穩(wěn)定性研究.pdf

1、丙酮酸脫氫酶系(Pyruvate dehydrogenase complex，PDHC)是線粒體基質(zhì)中的一類多酶復合物。其作用是催化丙酮酸氧化脫羧生成乙酰輔酶A、CO2、 NADH和H+。乙酰輔酶A進入三羧酸循環(huán)產(chǎn)生NADH和FADH2，與氧化磷酸化相偶聯(lián)，在細胞線粒體能量代謝中起著至關重要的作用。丙酮酸脫氫酶系由丙酮酸脫氫酶(PDHE1)、二氫硫辛酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(PDHE2)、二氫硫辛酸脫氫酶(PDHE3)三個酶組成，這三個酶協(xié)同完成相

2、應的催化過程。Leigh綜合征是嬰幼兒期亞急性、進行性、遺傳性神經(jīng)退行性疾病?；颊咚劳雎蕵O高，其發(fā)病機制尚不明確，但在患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)有PDHA1基因突變。PDHA1基因突變會造成PDHE1α結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導致PDHEα失活從而影響人體正常的物質(zhì)與能量代謝。研究發(fā)現(xiàn)，在阿爾茲海默癥、癲癇以及腫瘤中都存在PDHE1α功能缺失，而各種點突變對其結(jié)構(gòu)、功能、穩(wěn)定性的影響目前還知之甚少。因此，我們構(gòu)建文獻已報道的在各種疾病中發(fā)生頻率較高的不同PDH

3、E1α突變體，并將這些突變體在HEK293T細胞中過表達，以期通過分析不同的突變對PDHE1α結(jié)構(gòu)、功能與穩(wěn)定性的影響，深入理解PDHE1α突變引起的疾病發(fā)生的作用機理。
　　本研究通過基因克隆、重疊PCR與測序等方法成功構(gòu)建野生型及11個定點突變(D258A、D315N、F205L、L216F、M282L、R10P、R263G、R288H、R302C、 R378H、Y243N)的哺乳細胞pCMV6-PDHE1α重組表達載體。在此

4、基礎上，我們在HEK293T細胞中通過瞬時轉(zhuǎn)染的方法過表達PDHE1α（包括野生型與突變體），檢測突變對酶活力和代謝（葡萄糖與乳酸含量）造成的影響，以及缺氧條件對野生型與突變體表達的影響。其次通過免疫共沉淀檢測分子伴侶HSP90與PDHE1α的相互作用，并用HSP90抑制劑17-AAG處理過表達野生型與突變體PDHE1α的HEK293T細胞，Wenstern檢測HSP90抑制對野生型與突變體PDHE1α蛋白降解的差異，以此分析突變對其穩(wěn)

5、定性的影響。通過生物信息學同源模型構(gòu)建，分析突變對PDHE1α結(jié)構(gòu)的影響，并和17-AAG抑制HSP90的結(jié)果進行相互驗證與比對。結(jié)果表明：與野生型PDHE1α相比，各突變體在HEK293T細胞中過表達水平存在明顯差異;PDHE1α突變后，其酶活力均降低，細胞中葡萄糖含量降低，乳酸含量部分升高;免疫共沉淀結(jié)果顯示HSP90與PDHE1α存在相互作用;與野生型PDHE1α相比較，17-AAG抑制HSP90功能后，各種點突變導致PDHE1α