豬繁殖與呼吸綜合征病毒Nsp1蛋白鋅指結(jié)構(gòu)突變體構(gòu)建及其活性檢測.pdf

1、C o n s t r u c t i o no f P o r c i n e R e p r o d u c t i v ea n d R e s p i r a t o r y S y n d r o m e V i r u s N s p ’1P r o t e i n Z i n c F i n g e r S t r u c t u r e M u t a n t sa n d I t s A c t i v i t y D

2、 e t e c t i o n sT h e s i ss u b m i t t e d t oQ 薌n g D a o A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t yI n F u l f i l l m e n t o f t h e R e q u i r e m e n tf o r t h e D e g r e e o fM a s t e r o f A g r o n o m

3、yZ h a o P e n g w e i( D e p a r t m e n t o f A n i m a l S c i e n c ea n d V e t e r i n a r y M e d i c i n e )S u p e r v i s o r ：P r o f e s s o r W a n g J i n b a oQ i n g d a o ．C h i n a青島農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 摘要豬繁殖與呼吸綜

4、合征病毒N s p l 蛋白鋅指結(jié)構(gòu)突變體構(gòu)建及其活性檢測摘要豬繁殖與呼吸綜合征- ( P o r c i n e r e p r o d u c t i v e a n d r e s p i r a t o r ys y n d r o m e ，P R R S ) ，俗稱“豬藍耳病”，由豬繁殖與呼吸綜合征病毒( P R R S V ) g l 起豬的一種高度傳染性疫病，該病毒感染后可導(dǎo)致母豬流產(chǎn)、返情、產(chǎn)死胎或弱仔、仔豬死亡及各種

5、年齡豬不同程度的呼吸道癥狀，并且能夠破壞豬的免疫系統(tǒng)，引起混合感染和繼發(fā)感染，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。從山東省豬主要疫病的調(diào)查研究中發(fā)現(xiàn)，P R R S V 的感染率仍然很高，并且P R R S V能夠抵抗宿主的先天性免疫應(yīng)答，抑制I 型I F N 的產(chǎn)生，從而影響宿主獲得性免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。因此對P R R S V 的抑制機體I 型I F N 產(chǎn)生機制研究顯得尤為重要。目前，國外對P R R S V 的非結(jié)構(gòu)蛋白N s p l

6、研究發(fā)現(xiàn)，P R R S V 是引起機體I 型干擾素( I F N ) 下調(diào)的主要蛋白。但是這些研究都是針對N s p l 整個蛋白的研究，而對N s p l蛋白的氨基酸序列中具體起I 型I F N 下調(diào)作用的蛋白區(qū)段沒有做進一步的研究。本研究主要采用美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒S X ．1 株作為陽性對照，選取N s p l蛋白基因序列為模板，設(shè)計了2 條特異性的檢測引物擴增N s p l 基因。利用T m z o l 法提取總R N

7、 A ，R T - P C R 擴增目的基因，經(jīng)雙酶切構(gòu)建p C I ．n e o - N s p l 真核表達質(zhì)粒后對N s p l蛋白鋅指結(jié)構(gòu)I ( Z F I ) 的8 C 、1 0 C 、2 5 C 、2 8 C 的4 個位點進行定點突變，成功獲得分別突變?yōu)榻z氨酸和丙氨酸8 個突變體。轉(zhuǎn)染H e L a 細胞，通過間接免疫熒光方法( I F A ) 和W e s t e r n b l o t 檢測N s p l 鋅指結(jié)構(gòu)定點突

8、變體蛋白的活性。I F A 結(jié)果顯示，F(xiàn) l a g ：I ％體檢測時蛋白主要分布在細胞質(zhì)和細胞核中，M y c j g 體檢測時蛋白主要分布在細胞核中。W e s t e m b l o t 結(jié)果顯示，F(xiàn) l a g - f A 體檢測時，絲氨酸突變體出現(xiàn)大小約為4 4 k D a 和2 0 k D a 的條帶，丙氨酸突變體出現(xiàn)大約4 4 k D a , 條．帶；M y c 抗體檢測時絲氨酸突變體出現(xiàn)大小約為4 4 k D a 和2