吡非尼酮經(jīng)門靜脈灌注治療大鼠肝纖維化的作用及機制研究.pdf

1、1.目的:
　　肝臟纖維化是病毒性肝炎、酒精中毒、脂肪肝等各種慢性肝損傷的最終環(huán)節(jié)，是肝硬化發(fā)生、發(fā)展的病理基礎(chǔ)。迄今為止，尚未找到一種特殊有效的治療肝纖維化的藥物。吡非尼酮是一種新的口服廣譜抗纖維化小分子藥物，其在歐洲和美國已經(jīng)被批準(zhǔn)應(yīng)用于特發(fā)性肺纖維的臨床治療中，并取得了顯著療效。由于纖維化的發(fā)生具有相似的機制，所以人們將吡非尼酮其用于其他纖維化疾病的研究并取得了不錯的療效。而在肝纖維化治療中，吡非尼酮的療效及作用機制仍尚不明

2、確。本實驗擬探討吡非尼酮在體外對活化的肝星形細胞的作用及吡非尼酮經(jīng)灌胃、尾靜脈注射、肝動脈和門靜脈不同途徑給藥后，對二乙基亞硝胺誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型的治療作用及其機制，并篩選最佳給藥途徑，為臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　2.方法:
　　2.1吡非尼酮對LX-2細胞細胞周期、細胞增殖、遷移和分化的影響：體外培養(yǎng)LX-2細胞株，細胞狀態(tài)穩(wěn)定后將LX-2細胞分為2組，即空白對照組和藥物處理組。吡非尼酮作用于LX-2細胞24h后，流式細

3、胞儀檢測細胞周期、CCK-8法檢測細胞增殖的變化，劃痕愈合實驗觀察細胞遷徙能力的改變，免疫印跡法（Western Blot）檢測吡非尼酮對MCP-1蛋白表達的影響及qrt-PCR檢測吡非尼酮作用后膠原I表達的變化；
　　2.2二乙基亞硝胺誘導(dǎo)SD大鼠肝纖維化模型，造模成功后，將大鼠隨機分為6組，分別為（1）正常對照組（2）DEN模型對照組（3）吡非尼酮灌胃模型組（4）吡非尼酮經(jīng)尾靜脈給藥模型組（5）吡非尼酮經(jīng)肝動脈給藥模型組（6）

4、吡非尼酮經(jīng)門靜脈給藥模型組。藥物處理4周后抽取大鼠血清，檢測天門冬氨酸轉(zhuǎn)移酶（AST）和谷丙轉(zhuǎn)移酶(ALT)，麻醉處死各組動物模型，HE、Masson染色觀察纖維化情況，Western Blot和qrt-PCR檢測轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子7（Smad7）、MCP-1、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1（TIMP-1）、膠原伴侶分子47（HSP47）和Collagen I表達情況。
　

5、　3.結(jié)果:
　　3.1吡非尼酮處理LX-224h后，G1期明顯縮短，與對照組相比具有差異性（p<0.05）。明顯抑制細胞增殖（p<0.05），并且這種抑制作用具有濃度依賴性（p<0.05）；在0和24小時進行劃痕愈合測定，結(jié)果表明與對照組相比，吡非尼酮以劑量依賴的方式明顯抑制LX-2細胞的遷移能力（p<0.01）；Western Blot結(jié)果表明：吡非尼酮明顯抑制MCP-1蛋白的表達（p<0.05），并且這種抑制作用具有濃度依賴

6、性（p<0.05）； qrt-PCR結(jié)果表明：吡非尼酮明顯抑制Collagen I(實驗組/對照組)的表達（p<0.01），且抑制作用具有濃度依賴性（p<0.05）。
　　3.2吡非尼酮經(jīng)不同給藥方式治療DEN誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型后：與DEN模型對照組相比，PFD處理的DEN模型組中ALT、AST均明顯降低（p<0.05）；HE、Masson染色觀察：與DEN模型對照組相比，PFD可以明顯改善DEN誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型的肝組織

7、的肝纖維化情況，并且經(jīng)門靜脈給藥組效果最明顯；qrt-PCR檢測結(jié)果：與正常對照組相比，DEN誘導(dǎo)的模型組中TGF-β1、MCP-1、TIMP-1、MMP-2、Collagen I mRNA的表達明顯增加（p<0.01）；與DEN模型對照組相比，PFD灌胃組、PFD尾靜脈組、PFD肝動脈組、PFD門靜脈組TGF-β1、MCP-1、TIMP-1、MMP-2、Collagen I mRNA的表達均明顯降低（p<0.05）；其中在治療組間，M

8、MP-2 mRNA的表達在PFD灌胃組降低最顯著（p<0.01），但與PFD門靜脈組相比無統(tǒng)計學(xué)差異；TGF-β1、MCP-1、TIMP-1和Collagen I mRNA的表達則在PFD門靜脈組降低最明顯（p<0.01）；Western Blot檢測結(jié)果：（1）與正常對照組相比，DEN誘導(dǎo)的模型組中HSP47蛋白的表達明顯增加（p<0.01）；與DEN模型對照組相比，PFD灌胃組、PFD尾靜脈組、PFD肝動脈組、PFD門靜脈組HSP4

9、7蛋白的表達均明顯降低（p<0.05），并且PFD肝動脈組和PFD門靜脈組降低最明顯（p<0.05），但兩組之間無明顯統(tǒng)計學(xué)差異；（2）與正常對照組相比，DEN誘導(dǎo)的模型組中Smad7蛋白的表達明顯降低（p<0.01）；與DEN對照組相比，PFD灌胃組、PFD尾靜脈組、PFD肝動脈組、PFD門靜脈組Smad7蛋白的表達均明顯增加（p<0.05），并且PFD門靜脈組Smad7蛋白表達增加最明顯（p<0.05）。
　　4.結(jié)論:

10、>　?。?）吡非尼酮處理LX-2細胞后，該藥物能明顯影響LX-2細胞周期，抑制細胞增殖和遷移能力，并通過降低細胞外基質(zhì)的表達，減輕細胞增殖纖維化。
　?。?）經(jīng)門靜脈灌注PFD可以明顯減輕DEN誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型的肝臟炎癥反應(yīng)、保護肝細胞、降低纖維化程度。并通過下調(diào)TGF-β1、MCP-1、TIMP-1、MMP-2和HSP47細胞因子的表達以及上調(diào)Smad7的表達,抑制肝星形細胞的活化，阻止Collagen I的形成，延緩、逆