一種帕金森病三維細胞模型的構(gòu)建和分析.pdf

1、目的:
　　在體外通過建立三維細胞培養(yǎng)方式，為體外研究帕金森病發(fā)生及治療機制提供一種新的、更接近人體的模型。
　　方法:
　　本實驗首先利用人神經(jīng)母細胞瘤細胞SK-N-SH與鼠尾Ⅰ型膠原建立起三種培養(yǎng)模式:1.三維細胞模型培養(yǎng);2.鼠尾Ⅰ型膠原鋪板后再將SK-N-SH細胞種植在這種單層膠原鋪板的孔板上，我們稱作coated細胞模型培養(yǎng);3.直接將細胞鋪在孔板上，稱作二維細胞模型培養(yǎng)。利用環(huán)境毒素1-甲基-4-苯基吡啶(

2、MPP+)處理以上三種培養(yǎng)模型，建立帕金森病體外疾病細胞模型。用MTT方法分析各細胞模型在藥物處理后的細胞活性;實時熒光定量PCR(QPCR)的方法檢測各個模型在藥物處理后α-synuclein表達量的變化;倒置光學顯微鏡、掃描電鏡及HE染色方法比較三維模型中SK-N-SH細胞經(jīng)藥物處理前后形態(tài)的變化。免疫熒光檢測α-synuclein在不同模型中經(jīng)藥物處理前后的表達變化。所有數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析，兩組比較采用成組t檢驗。<

3、br>　　結(jié)果:
　　1、細胞對MPP+的毒性敏感性下降:
　　MTT比色法檢測發(fā)現(xiàn)MPP+對神經(jīng)母細胞瘤細胞SK-N-SH具有損傷作用，其損傷作用具有劑量依賴性。在傳統(tǒng)二維培養(yǎng)中，MPP+(1mmol/L)處理SK-N-SH細胞24小時后細胞活力較對照組明顯下降(50.7％)，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01），但是在三維模型組與coated細胞模型組中，我們發(fā)現(xiàn)MPP+處理24小時后，細胞活性較對照組下降不明顯，為對照組

4、的74.5％。且三維細胞模型組的細胞經(jīng)藥物處理48小時后，細胞活性與對照組相比僅降低33.8％。
　　2、細胞在三維模型表面的形態(tài)特點:
　　掃描電鏡顯示，Ⅰ型膠原材料制成的三維模型呈纖維樣交織，并有一定的空隙。細胞在三維模型里面呈類球形生長，可發(fā)現(xiàn)細胞間突起交匯。與對照組相比，MPP+處理后24小時，處理組中的細胞出現(xiàn)皺縮趨勢，細胞突起縮短，減少。三維模型表面出現(xiàn)的異常高密度聚合物，我們猜測是皺縮的細胞。但在三維模型切片，

5、HE染色顯示，從模型的頂部到底部都有細胞分布，經(jīng)過MPP+處理24小時后，與對照組相比，細胞形態(tài)未發(fā)生明顯的改變。
　　3、Alpha-synuelein表達量增加:
　　MPP+處理24小時后，三維模型組α-synuclein表達量與對照組相比出現(xiàn)上升，差別具有統(tǒng)計學意義，但與傳統(tǒng)二維模型組及coated細胞模型組相比（分別為5.2倍，6.3倍），其僅上升了1.9倍。
　　4、Alpha-synuclein聚合物從細

6、胞核向細胞質(zhì)或者細胞基質(zhì)轉(zhuǎn)移:
　　MPP+處理24小時后，三維模型α-synuclein蛋白在核周圍聚集明顯增多，可以觀察到在細胞質(zhì)及臨近細胞膜部分有較大顆粒狀α-synuclein聚合物沉積，而在MPP+處理48小時后，核周及細胞基質(zhì)中的α-synuclein聚集現(xiàn)象不明顯，提示24小時后，α-synuclein聚合物已從細胞質(zhì)向細胞外轉(zhuǎn)移。在傳統(tǒng)二維模型組及coated組中僅發(fā)現(xiàn)處理組細胞的α-synuclein表達出現(xiàn)增加

7、，而并未發(fā)現(xiàn)α-synuclein聚合物沉積的現(xiàn)象。
　　結(jié)論:
　　1、三位細胞模型培養(yǎng)狀態(tài)下，神經(jīng)母細胞瘤細胞SK-N-SH對MPP+的毒性敏感性下降;
　　2、在體外展示了在三維環(huán)境中的細胞形態(tài)，以及在藥物處理之后的形態(tài)變化;
　　3、三維模型在MPP+處理24小時后觀察到α-synuclein表達量增加，異常聚集，并且發(fā)生異位。
　　本研究首次利用三維細胞培養(yǎng)模型經(jīng)過藥物處理成功構(gòu)建體外帕金森疾病模