帕金森病模型大鼠神經(jīng)干細(xì)胞移植基礎(chǔ)研究.pdf

1、帕金森病(Parkinson's disease，PD)是一種發(fā)生于中老年期的，緩慢進(jìn)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要病理改變?yōu)橹心X黑質(zhì)致密部(substantia nigrapars compacta，SNc)多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元變性死亡，導(dǎo)致紋狀體來自黑質(zhì)的DA能神經(jīng)末梢減少，從而引起震顫、肌肉僵直、運(yùn)動(dòng)遲緩與體位不穩(wěn)等一系列綜合病癥(Lotharius and Brundin，2002)。PD是繼阿爾茨海默病(Al

2、zheimer's disease，AD)之后第二大常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，隨著人口平均壽命延長和老齡化出現(xiàn)，PD的發(fā)病率呈現(xiàn)明顯的上升勢頭。藥物治療以及腦深部電極(deep-brain stimulation，DBS)埋藏治療可在一定程度上緩解患者的癥狀，但都存在一些副作用，而且不能從根本上抑制腦內(nèi)DA能神經(jīng)元的持續(xù)性死亡。近年來神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)的研究為細(xì)胞替代療法治療PD提供了潛在的應(yīng)用前

3、景，通過移植神經(jīng)干細(xì)胞不但可以來替代部分丟失的的DA能神經(jīng)元的功能，而且可以通過移植具有分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子特性的細(xì)胞抑制DA能神經(jīng)元的丟失，長期有效地改善患者的癥狀。
　　 在本研究的第一部分，我們利用本實(shí)驗(yàn)室建立的胚胎大鼠NSCs的取材和培養(yǎng)方法，分離E14 SD大鼠胚胎前腦室下帶區(qū)(subventricularzone，SVZ)神經(jīng)組織，在含有多種神經(jīng)營養(yǎng)因子的無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)，經(jīng)傳代后培養(yǎng)出大量NSCs標(biāo)記分子--神經(jīng)

4、巢蛋白(neuro epithelial stem cell protein，Nestin)陽性克隆球團(tuán)。經(jīng)免疫組織化學(xué)方法檢測，這些陽性細(xì)胞克隆球團(tuán)經(jīng)誘導(dǎo)分化后可以分化為神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，此結(jié)果說明本實(shí)驗(yàn)取自E14 SD大鼠SVZ區(qū)域的細(xì)胞具有自我增殖和多潛能分化特性。為長期跟蹤移植細(xì)胞在體內(nèi)存活、生長、遷移及分化的過程，我們運(yùn)用用攜帶有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent pro

5、tein，EGFP)基因的重組腺相關(guān)病毒(rAAV2-EGFP)在體外培養(yǎng)條件下感染NSCs，通過病毒在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)EGFP使細(xì)胞帶有綠色熒光標(biāo)記。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，被AAV2-EGFP感染后的NSCs仍具有持續(xù)的分裂增殖能力。EGFP標(biāo)記的NSCs體外誘導(dǎo)分化后，整個(gè)細(xì)胞從胞體到突起末梢都帶有綠色熒光標(biāo)記，較好顯示出了細(xì)胞的完整形態(tài)，經(jīng)測定，體外EGFP標(biāo)記率為65％。在第一部分研究，我們成功建立了NSCs的分離、培養(yǎng)、鑒定和EGFP標(biāo)記示蹤

6、的方法。
　　 PD在動(dòng)物中沒有自發(fā)傾向，進(jìn)行PD實(shí)驗(yàn)研究需要建立適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型(陳生弟，陳先文，2003)。建立穩(wěn)定的能模擬人類PD病理學(xué)和行為學(xué)改變的動(dòng)物模型，對PD的發(fā)病機(jī)制和治療等方面的研究具有重要的意義。PD大鼠模型由于可直接觀察行為學(xué)改變、經(jīng)濟(jì)和易于操作等原因，成為目前應(yīng)用最廣的研究模型?，F(xiàn)在PD模型的制作方法較為成熟，常用的是6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)損毀模型。在第二部分實(shí)驗(yàn)

7、中，我們采用了單點(diǎn)內(nèi)側(cè)前腦束(medialforebrain bundle，MFB)注射6-OHDA方法制備一側(cè)黑質(zhì)損毀PD動(dòng)物模型。共制備模型105只SD大鼠(Sprague Dawley，SD)。建模4周后經(jīng)阿樸嗎啡(apomorphine，APO)誘發(fā)旋轉(zhuǎn)，旋轉(zhuǎn)7 r/min以上者為成功模型，共有57只，行為學(xué)檢測造模成功率為54％。模型動(dòng)物造模成功后分別在30，60和120天后再次進(jìn)行行為學(xué)檢測以跟蹤動(dòng)物的自我恢復(fù)可能性，統(tǒng)計(jì)結(jié)

8、果顯示與造模成功后的初次檢測結(jié)果無顯著性差異(P>0.05)，表明PD模型穩(wěn)定，沒有自我修復(fù)現(xiàn)象。對PD模型組動(dòng)物中腦黑質(zhì)酪氨酸羥化酶(tyrosion hydrozylase，TH)免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，成功PD大鼠中腦黑質(zhì)正常側(cè)TH反應(yīng)陽性神經(jīng)元數(shù)量較多，胞體較大，突起明顯；而6-OHDA損毀側(cè)TH陽性神經(jīng)元數(shù)量則明顯減少，細(xì)胞丟失超過90％以上。120天后PD模型動(dòng)物損傷側(cè)神經(jīng)元數(shù)量減少仍然在90％以上，從組織學(xué)上證明模型的穩(wěn)定。

9、我們對成功的PD模型大鼠和正常大鼠分別在黑質(zhì)或紋狀體移植rAAV2-EGFP標(biāo)記的NSCs，移植后30、60和120天進(jìn)行行為學(xué)檢測。結(jié)果表明，NSCs移植到PD大鼠黑質(zhì)或者紋狀體，隨著移植細(xì)胞在宿主腦內(nèi)存活時(shí)間的延長，動(dòng)物的行為學(xué)癥狀得到顯著改善(P<0.05，P<0.01)。
　　 在NSCs移植療法中，NSCs作為一種外源性物質(zhì)能否在損傷的黑質(zhì)區(qū)域存活或者遷移，能否向黑質(zhì)特定DA能神經(jīng)元分化是細(xì)胞移植治療PD療效的關(guān)鍵。在

10、第三部分實(shí)驗(yàn)中我們研究了移植細(xì)胞的行為變化。在細(xì)胞移植后30、60和120天不同時(shí)期取腦進(jìn)行連續(xù)切片，在移植后不同時(shí)間的腦片上我們均發(fā)現(xiàn)了大量EGFP標(biāo)記的細(xì)胞，說明EGFP作為示蹤記在細(xì)胞移植后仍然長期穩(wěn)定表達(dá)，外源性的NSCs可以通過異體移植在宿主內(nèi)長期存活。對各時(shí)間段有移植細(xì)胞標(biāo)記的腦片進(jìn)行免疫組化檢測，結(jié)果顯示移植的細(xì)胞可以分化為多種神經(jīng)元，星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。通過EGFP的示蹤顯示，移植細(xì)胞具有遷移現(xiàn)象并存在一定規(guī)律。

11、移植到黑質(zhì)的細(xì)胞隨著時(shí)間的延長，在黑質(zhì)區(qū)遷移的距離也越遠(yuǎn)，但總體上移植細(xì)胞是在受損的黑質(zhì)區(qū)域內(nèi)遷移，只有少量的細(xì)胞遷移到黑質(zhì)區(qū)域以外。移植到紋狀體的細(xì)胞呈條索狀排列從移植位點(diǎn)向腹后內(nèi)側(cè)黑質(zhì)部位進(jìn)行較為廣泛的長距離遷移，遷移具有明顯的方向性并在黑質(zhì)致密部可見散在移植細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示移植的NSCs可以在體內(nèi)存活并有遷移和分化能力，CNS損傷區(qū)微環(huán)境對移植細(xì)胞的遷移和分化具有一定誘導(dǎo)作用。
　　 綜上所述，我們得出以下結(jié)論：

12、　　 1,從E14天胚胎大鼠SVZ分離出來的神經(jīng)細(xì)胞群，能不斷的更新和增殖，具有良好的可傳代性，體外培養(yǎng)可以誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元，星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞等多種類型，具有自我增殖和多潛能分化的干細(xì)胞特性。利用rAAV2-EGFP感染NSCs，可以使NSCs帶有穩(wěn)定綠色熒光標(biāo)記，標(biāo)記后NSCs仍具有增殖和分化特性。成功建立了胚胎大鼠NSCs的培養(yǎng)、鑒定和EGFP示蹤標(biāo)記方法。
　　 2,單點(diǎn)MFB注射6-OHDA制備一側(cè)黑質(zhì)損毀P

13、D動(dòng)物模型，應(yīng)用免疫組化和行為學(xué)檢測證明模型制作成功、可靠并可以長期保持穩(wěn)定。用體外培養(yǎng)的rAAV2-EGFP標(biāo)記的NSCs移植PD模型大鼠紋狀體或者黑質(zhì)，隨著移植細(xì)胞在宿主腦內(nèi)存活時(shí)間的延長，可以明顯改善PD動(dòng)物行為學(xué)癥狀。
　　 3，跟蹤NSCs移植后不同時(shí)間段移植細(xì)胞的分化和遷移特性。移植細(xì)胞在宿主腦內(nèi)分化為多種神經(jīng)元，星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。移植細(xì)胞具有遷移現(xiàn)象并存在一定規(guī)律。移植到黑質(zhì)的細(xì)胞總體上在受損的黑質(zhì)區(qū)域內(nèi)