帕金森病模型定稿

1、帕金森病動(dòng)物模型,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)：四組組員：張?chǎng)?、趙向男、 張巖、李曉 2016.11.14,,,,,帕金森病又稱震顫麻痹，是一種由于腦內(nèi)黑質(zhì)紋狀體通路多巴胺缺乏所致的，在老年人中常見的進(jìn)行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。,此病主要病理特征為黑質(zhì)多巴胺(DA)能神經(jīng)元缺失及胞質(zhì)內(nèi)包涵體--路易小體(Lewy body)出現(xiàn),,,,主要癥狀,,,,,靜止性震顫,肌強(qiáng)直,運(yùn)動(dòng)遲緩,體位不平衡、步態(tài)紊亂,,焦慮、睡眠障礙等

2、非運(yùn)動(dòng)癥狀,,,,,,脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元,,調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)功能,黑質(zhì),紋狀體,DA,ACh,作用過程,,,,,正常,,,,,帕金森病,多巴胺,多巴胺,乙酰膽堿,乙酰膽堿,Jame Parkinson首先在1817年對(duì)帕金森病的臨床表現(xiàn)進(jìn)行了描述。當(dāng)時(shí)，對(duì)PD的發(fā)病機(jī)制幾乎一無所知。直到20世紀(jì)50年代Carlson等對(duì)嚙齒類動(dòng)物注射利血平后，使動(dòng)物產(chǎn)生類似PD樣癥狀，這是最早建立的PD動(dòng)物模型。,PD動(dòng)物模型的發(fā)展,隨著對(duì)兒茶酚胺特異性神經(jīng)

3、毒素六羥基多巴胺(6-Hydroxydopamine，6-OHDA)的認(rèn)識(shí)，在1968年Vngerstedt等人成功地建立6-OHDA動(dòng)物模型。之后，于1983年Brundin等報(bào)道了利用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6四氫吡啶(MPTP)制作小鼠和猴的PD動(dòng)物模型。,在國(guó)內(nèi)，周厚廣等用兩點(diǎn)注射法將6-OHDA注入大鼠一側(cè)的黑質(zhì)及內(nèi)側(cè)前腦束，成功率高達(dá)71.1%，電鏡觀察可見中腦黑質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞普遍存在變性壞死及不同階段的凋亡改變，可以較

4、快地建立穩(wěn)定地成功率較高的類似于人類中晚期帕金森病行為和病理的大鼠模型。隨著研究的深入，相繼出現(xiàn)了NO、Fe3+及機(jī)械損傷的PD動(dòng)物模型，根據(jù)研究目的的不同，選擇不同的PD動(dòng)物模型。,帕金森病動(dòng)物模型的制備,為模擬人類PD，理想的動(dòng)物模型應(yīng)具備以下一些特點(diǎn)：,（1）多巴胺能神經(jīng)元在出生時(shí)數(shù)量及形態(tài)正常，青年時(shí)期開始逐漸選擇性地減少，減少量超過50％，且容易通過神經(jīng)化學(xué)和神經(jīng)生理學(xué)的方法檢測(cè)到； （2）模型應(yīng)能容易檢測(cè)其運(yùn)動(dòng)功能的損傷，

5、包括運(yùn)動(dòng)遲緩、肌僵直和靜止性震顫等PD的主要癥狀；,（3）模型應(yīng)能顯示出路易小體的形成； （4）如果模型是遺傳性的，應(yīng)基于單一突變而使突變模型有著強(qiáng)大的傳播能力； （5）模型應(yīng)有相對(duì)較短的疾病周期（如數(shù)月），以使藥物篩選得以經(jīng)濟(jì)、快速地進(jìn)行。,①通過在大鼠的黑質(zhì)或內(nèi)側(cè)前腦束注射6羥多巴胺（6-OHDA）②通過對(duì)模型動(dòng)物(如:猴、小鼠、豬等)進(jìn)行1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶（MPTP）的管飼法和立體定位注射等方法,國(guó)

6、際通用國(guó)內(nèi)應(yīng)用較多是兩種方法：,模型制備方法,前者是較精典的模型制備的方法，也是在國(guó)內(nèi)較早開展的，但是由于神經(jīng)元的毀損出現(xiàn)的較早，這與臨床PD病人的中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的漸進(jìn)性死亡不同； 近距離的毀損很難把握毀損的程度，這使得采用這種方法獲取部分損毀的模型的成功率很低；,存在的問題,較之前者采用MPTP管飼法和立體定位注射方法，在國(guó)內(nèi)最近幾年才運(yùn)用到帕金森動(dòng)物模型的制備，國(guó)外已經(jīng)利用MPTP在猴和小鼠身上建立了較為理想的PD模

7、型，制備通常采用皮下、靜脈、腹腔注射和肌肉給藥，具有方法可靠且重復(fù)性較好。但是其危險(xiǎn)性較高，對(duì)于試驗(yàn)人員和試驗(yàn)條件有著嚴(yán)格的要求,模型制備,應(yīng)用6-OHDA制備偏側(cè)PD鼠模型,應(yīng)用MPTP制備PD動(dòng)物模型,其它建模方法,應(yīng)用6-OHDA制備偏側(cè)PD鼠模型,1）雄性Sprague-Dawley大鼠，體重230～250g2）戊巴比妥鈉(30mg/kg)麻醉后，固定于立體定向儀3）參照大鼠腦立體定位圖譜,取兩個(gè)靶點(diǎn)，將12µg

8、6- OHDA立體定向注射于右側(cè)黑質(zhì)a、b兩個(gè)靶點(diǎn)(每點(diǎn) 注射量6µg，濃度2µg／µl，溶解于含0.1%抗壞血酸 的生理鹽水中)。注射速度0.3µl／min．注畢留針 15min。,應(yīng)用MPTP制備PD動(dòng)物模型,靈長(zhǎng)類PD模型,恒河猴戊巴比妥腹腔麻醉下，切開頸部皮膚，暴露一側(cè)頸總動(dòng)脈。將新鮮配制的MPTP按1.0～1.5mg／kg體重溶于2mL

9、生理鹽水中，逆血流方向緩慢注入血管中。若動(dòng)物在第1次手術(shù)后PD癥狀不明顯，分別在每隔5d后又給予第2～4次注射，直至PD癥狀出現(xiàn)。,小鼠PD模型,小鼠對(duì)MPTP的敏感性存在種系和年齡的差異。一般選10~12周齡，體重25~30g成年C57BL褐鼠，按體重30~40 mg／kg腹腔注射MPTP，連續(xù)7d。于第6~7次注射后出現(xiàn)暫時(shí)性(2~3h)軀干震額、豎毛、尾巴過伸、動(dòng)作減少及爬桿試驗(yàn)障礙,利血平主要可以通過抑制去甲腎上腺素能神經(jīng)元末梢

10、的再攝取功能，使囊泡內(nèi)貯存的多巴胺(DA)及其他的兒茶酚胺類遞質(zhì)耗竭。將雄性Wistar大鼠(體重280—300g)腹腔內(nèi)注射一定劑量的利血平后可使其出現(xiàn)骨傷肌慢硬、震顫、身體屈曲、運(yùn)動(dòng)過少以及其他的一些運(yùn)動(dòng)癥狀。神經(jīng)化學(xué)分析發(fā)現(xiàn)大鼠紋狀體內(nèi)DA和其他單胺類遞質(zhì)的含量明顯減少,利血平模型,其它建模方法,它存在明顯的不足：一是藥物注射造成的運(yùn)動(dòng)障礙在不同時(shí)間和不同個(gè)體之間變異性較大；二是利血乎同時(shí)引起了多種遞質(zhì)釋放并且無法造成類似PD的病

11、理改變。因此該模型的應(yīng)用只局限于探索藥物影響肌僵狀態(tài)的實(shí)驗(yàn)中，對(duì)其他的運(yùn)動(dòng)癥狀的研究現(xiàn)已很少應(yīng)用,1991年Ben-Shachar在雄性SD大鼠(250~300g)單側(cè)黑質(zhì)內(nèi)注射Fe3+三周后可使其出現(xiàn)明顯的運(yùn)動(dòng)行為改變，表現(xiàn)為在新環(huán)境中自主運(yùn)動(dòng)減少，短暫的僵直癥狀及自發(fā)的同測(cè)旋轉(zhuǎn)行為。,Fe3+模型,研究發(fā)現(xiàn)機(jī)械損傷內(nèi)側(cè)前肋束(MF可以造成黑質(zhì)內(nèi)的DA能神經(jīng)元進(jìn)行性死亡。已經(jīng)建立的造模方法有MFB獨(dú)突切斷術(shù)和中腦半切術(shù)，尤以前者應(yīng)用較

12、多。,機(jī)械損傷模型,用該方法造模有如下優(yōu)點(diǎn)：①成功率高，較為經(jīng)濟(jì)。②黑質(zhì)DA能神經(jīng)元呈現(xiàn)漸進(jìn)性死亡，可以模擬PD病理變化的全過程，對(duì)于研究神經(jīng)元的再生和PD的預(yù)防有一定的意義。缺點(diǎn)是切斷術(shù)后短時(shí)間內(nèi)，損傷的程度不穩(wěn)定。,6-OHDA大鼠模型：在注射6-OHDA后連續(xù)6周進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)，用阿樸嗎啡腹腔注射，1～5分鐘后出現(xiàn)旋轉(zhuǎn),旋轉(zhuǎn)時(shí)以健側(cè)后肢為支點(diǎn),身體向健側(cè)彎曲,首尾相接,原地轉(zhuǎn)動(dòng)。有的甚至出現(xiàn)翻轉(zhuǎn),有的呈小環(huán)行旋轉(zhuǎn)，速度&

13、gt;7r/min視為成功模型。通過旋轉(zhuǎn)記錄儀計(jì)算一定時(shí)間內(nèi)旋轉(zhuǎn)的總次數(shù)，可以粗略估計(jì)大鼠腦內(nèi)DA能神經(jīng)元的死亡程度。,動(dòng)物模型的評(píng)價(jià),行為學(xué)測(cè)試,MPTP致靈長(zhǎng)類PD模型： 腹腔注射或靜脈注射MPTP第2天，動(dòng)物即出現(xiàn)自發(fā)性運(yùn)動(dòng)減少，呈進(jìn)行性加重，以至于運(yùn)動(dòng)不能，弓背姿勢(shì)，四肢緊張性彎曲，肌強(qiáng)直伴震顫，吞咽困難，不能進(jìn)食及發(fā)音減弱。,MPTP小鼠模型： 爬桿實(shí)驗(yàn)：將一直徑為25cm的軟木小球固定于一

14、根長(zhǎng)50cm、粗1cm的木桿頂部,木桿上纏上紗布以防打滑，然后將被測(cè)小鼠放到小球上，并記錄以下時(shí)間：小鼠從小球上下來所需的時(shí)間，小鼠爬完稈子的上半部和下半部所需的時(shí)間。,游泳實(shí)驗(yàn)：將受試小鼠放入一個(gè)20×30×20cm的水箱中，水溫為22℃～25℃。若在受試時(shí)間內(nèi)能連續(xù)不斷的游泳者記3分，大部分時(shí)間游泳僅偶爾漂浮者記2.5分，漂浮時(shí)間占整個(gè)受試時(shí)間50%以上者記2.0分，偶爾游泳者記0.5分，偶爾用后肢游動(dòng)并漂浮在一

15、起者記1.0分。以正常小鼠作為對(duì)照，最后計(jì)算得分情況，并作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。,將PD動(dòng)物麻醉后，用0.9%鹽水和4%多聚甲醛灌注固定，連續(xù)冰凍切片，行酪氨酸羥化酶免疫組織化學(xué)染色。毀損一側(cè)黑質(zhì)和腹側(cè)背蓋區(qū)的TH陽性神經(jīng)元明顯消失，而同一腦片健側(cè)可見大量TH陽性神經(jīng)元。,形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià),利用高效液相2電化學(xué)法測(cè)定PD模型黑質(zhì)及紋狀體中多巴胺及其代謝產(chǎn)物高香草酸(HVA)含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各種動(dòng)物模型毀損側(cè)黑質(zhì)、紋狀體內(nèi)DA、HVA含量均顯著降低。,神經(jīng)

16、生化改變,,,,,,,,,,治療,金剛烷胺,左旋多巴,抗膽堿能 藥物,多巴胺受體 激動(dòng)劑,抗膽堿能藥物,藥物：東莨菪堿、鹽酸苯海索,作用：1、能維持紋狀體的遞質(zhì)平衡 2、對(duì)震顫和肌強(qiáng)直有效,金剛烷胺,1、促進(jìn)神經(jīng)末梢釋放多巴胺，并阻止 其再攝??；2、能改善震顫、肌強(qiáng)直和運(yùn)動(dòng)遲緩等 癥狀。,左旋多巴制劑,左旋多巴合并多巴脫羧酶抑制劑是目前最有效的藥物。 對(duì)各期病人都有效，但一般主張病人出現(xiàn)姿勢(shì)平衡

17、障礙或工作受到影響時(shí)使用，它對(duì)運(yùn)動(dòng)遲緩和肌強(qiáng)直療效好，對(duì)震顫亦有效。,多巴胺受體激動(dòng)劑,1、早期：可延緩多巴胺代替藥物的使 用；2、中晚期：改善癥狀，并減少替代藥 物的用量。,隨著對(duì)PD的發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入，目前，已有學(xué)者應(yīng)用PD患者血清IgG、脂多糖(LPS)、鐵離子(Fe3+)、32氮基酪氨酸注射于單側(cè)黑質(zhì)來建立偏側(cè)PD大鼠模型。VanderPutten等已成功地制備了α-synuclein轉(zhuǎn)基因小鼠和轉(zhuǎn)基因果蠅，

18、高表達(dá)人類α-synuclein的轉(zhuǎn)基因小鼠具有PD的部分特征?？傊?，目前建立的PD動(dòng)物模型都是使動(dòng)物在短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)帕金森病的癥狀或病理變化，很難模仿帕金森病這一神經(jīng)系統(tǒng)的慢性疾病的自然進(jìn)程。因此，獲得一種更為理想的帕金森病動(dòng)物模型，將更有利于對(duì)帕金森病的發(fā)病機(jī)制及實(shí)驗(yàn)治療進(jìn)行深入研究。,機(jī)遇與挑戰(zhàn),除上述模型，McNaught等還建立了EpoxomicinPD動(dòng)物模型。Epoxomicin為一種蛋白酶體抑制劑，此模型為研究人類PD相關(guān)

19、的運(yùn)動(dòng)障礙和病理病因?qū)W提供了一個(gè)很有價(jià)值的平臺(tái)。目前，在常染色體顯性PD家族患者腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)的高表達(dá)突變的亮氨酸豐富區(qū)重復(fù)激酶2(leucine2richrepeatkinase2，LRRK2)在PD發(fā)病過程中可能具重要作用，為建立新的基因模型提供了理論基礎(chǔ)。此外，采用細(xì)菌人工染色體(bacterialartificialchromosome，BAC)技術(shù)介導(dǎo)α-synuclein轉(zhuǎn)基因鼠模型也將成為今后研究PD致病機(jī)制的有力工具。

20、0;  盡管目前尚無完全理想的PD模型,但隨著PD分子發(fā)病機(jī)制研究的逐步深入，相信PD動(dòng)物模型的建立將更日臻完善。,參考文獻(xiàn),1、王彥永，顧平.建立帕金森病動(dòng)物模型的研究進(jìn)展， 中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2004， 21（4）：379-3822、陳歡意，牛平.帕金森病動(dòng)物模型的研究進(jìn)展，解 剖科學(xué)進(jìn)展, 2005, 11(4):362-3663、王 濤,左萍萍.帕金森病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型研究進(jìn)