miR-144-451與β地中海貧血的關系及姜黃素的干預作用.pdf

1、β地中海貧血(β-thalassemia)是常見的單基因遺傳性疾病，其發(fā)病機制是由于β珠蛋白基因突變引起β珠蛋白肽鏈合成減少或完全缺如，造成與β珠蛋白相匹配的α珠蛋白鏈表達相對過剩，過剩的α鏈在紅細胞膜上沉淀形成包涵體，最終導致紅細胞前體細胞凋亡增加等臨床癥狀，屬于慢性溶血性貧血的一種。流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)目前全球β珠蛋白突變基因攜帶者超過7500萬，β地中海貧血的突變類型達200多種。該疾病主要分布在地中海地區(qū)、中非洲、亞洲、南太平洋地區(qū)

2、以及中國南方地區(qū)，在我國，廣東、廣西、海南、澳門及香港五省區(qū)為高發(fā)區(qū)。β地中海貧血發(fā)病率高，2009年廣西自治區(qū)婦幼衛(wèi)生監(jiān)測到重癥β地中海貧血發(fā)生率為2.58％?；颊呖傮w生存時間短，生存質(zhì)量及預后差，且尚無有效治療方法，為家庭、社會均造成嚴重負擔。因此，探索安全有效的治療方法，對人類β地中海貧血的治療具有重要價值。
　　miRNA(microRNA)是一種非編碼小分子RNA，通過與靶基因的特異性堿基互補結合，降低靶基因的穩(wěn)定性或抑

3、制其合成，參與多種生物的細胞發(fā)育、增殖及分化等過程，與人類多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。研究表明，miRNAs在紅細胞分化和成熟過程中發(fā)揮重要作用。
　　miR-144和miR-451是一個雙順反子miRNA基因位點。2005年，miR-451從人腦垂體RNA中提取并命名，與miR-144相鄰并定位于人類染色體17q11.2。在小鼠中，miR-144與miR-451相鄰并位于11號染色體，該基因簇具有共同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控啟動子。迄今為止，

4、作為小分子RNA，miR-144/451在成熟紅細胞中表達量最高。RNA測序結果表明，miR-451的表達量約占據(jù)紅細胞發(fā)育晚期miRNA的50％。大量體內(nèi)外實驗發(fā)現(xiàn)，miR-144/451在紅細胞發(fā)育成熟過程中和珠蛋白合成中起到關鍵作用。在紅細胞成熟晚期，miR-451表達紊亂會引起相應的紅細胞成熟障礙或分化停滯，從而引起相應的疾病。例如在真性紅細胞增多癥、鐮刀性貧血等多種血液系統(tǒng)疾病中存在miR-144/451的表達失調(diào)。有報道發(fā)現(xiàn)

5、，β地中海貧血患者的前體紅細胞中miR-451的表達上調(diào)。這些均提示miR-144/451參與紅細胞疾病的發(fā)生，因此，研究miR-144/451在紅細胞疾病中的表達失調(diào)及其作用機制可為開發(fā)新的靶向治療藥物提供依據(jù)。
　　機體內(nèi)氧化應激所產(chǎn)生的活性氧類（reactive oxygen species，ROS）可損傷細胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)的生理功能，是臨床許多疾病發(fā)生發(fā)展的病理生理學基礎。研究發(fā)現(xiàn)，核因子NF-E2相關因子(n

6、uclear factor erythroid2-related factor2，Nrf2)在保護機體免受氧化應激損傷的過程中起到關鍵作用，Nrf2通過與抗氧化反應元件(antioxidantresponsive element，ARE)結合后相互作用調(diào)節(jié)編碼抗氧化蛋白的產(chǎn)生，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最重要的內(nèi)源性抗氧化應激通路。生物信息學預測發(fā)現(xiàn)，miR-144可通過堿基互補原則與Nrf2的3'非翻譯區(qū)（3'-untranslated reg

7、ion，3'UTR）綁定結合，研究發(fā)現(xiàn)miR-144在鐮刀狀貧血患者體內(nèi)可靶向調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的表達，從而在鐮刀狀貧血疾病的發(fā)展中起到關鍵的調(diào)控作用。β地中海貧血時，ROS水平是否有升高？此外，miR-144是否可通過堿基互補結合在Nrf2的3'UTR從而調(diào)控Nrf2的翻譯表達進而調(diào)控β地中海貧血疾病的發(fā)生發(fā)展？
　　α血紅蛋白穩(wěn)定蛋白(Alpha-hemoglobin stabilizing protein，AHSP)，也稱

8、做紅細胞系分化相關因子（erythroid differentiation-related factor, EDRF），在體內(nèi)起到維持α和β珠蛋白穩(wěn)定的關鍵作用。生理及病理狀態(tài)下，AHSP與紅細胞內(nèi)游離的α珠蛋白結合形成復合物，可特異性使α珠蛋白保持溶解狀態(tài)，阻止其沉淀。研究發(fā)現(xiàn)AHSP敲除小鼠紅細胞形態(tài)改變，壽命縮短，且脾臟增大，β地中海貧血小鼠敲除AHSP后，小鼠貧血癥狀加劇，以上研究結果說明AHSP具有重要的生理作用。我們通過生物

9、信息學預測發(fā)現(xiàn)miR-144/451成熟系列可通過堿基互補特異性結合AHSP的mRNA序列，但miR-144/451是否可調(diào)控AHSP的表達從而在β地中海貧血中起到作用，目前尚不清楚。
　　此外，大量研究發(fā)現(xiàn)γ珠蛋白的高表達可改善β地中海貧血。γ珠蛋白的表達水平與β地中海貧血患者貧血程度呈負相關。因此，各種提高γ珠蛋白表達的基因治療等方法紛紛出現(xiàn)。然而，miR-144/451是否與γ珠蛋白之間存在直接或間接的關系，至今未見報道。<

10、br>　　中藥單體姜黃素(Curcumine)廣泛存在于姜科植物姜黃根莖中，是其主要活性成分之一，研究表明姜黃素具有較強的抗炎抗氧化、調(diào)節(jié)免疫活性的生物作用，并且毒性較小，但在β地中海貧血治療中姜黃素是否具有抗氧化功能從而起到改善貧血的作用，未見相關研究。
　　本課題組前期已發(fā)表的實驗數(shù)據(jù)表明miR-144/451具有較強的抗氧化應激作用，其作用機制是通過抑制靶基因Ywhaz的翻譯，導致靶蛋白的表達量減少，從而促進抗氧化酶的轉(zhuǎn)錄。

11、同時，本課題組實驗結果發(fā)現(xiàn)，β地中海貧血小鼠體內(nèi)的miR-144/451表達量明顯升高，將β地中海貧血模型小鼠與miR-144/451基因敲除小鼠雜交后，對雜交鼠進行相關基因型鑒定，發(fā)現(xiàn)當β地中海貧血小鼠體內(nèi)miR-144/451表達缺失時，其貧血等癥狀明顯改善。因此，本研究為進一步明確這種貧血改善的現(xiàn)象并闡明貧血改善的分子機制，以期為開發(fā)相關靶向治療藥物提供理論基礎和實驗依據(jù)。
　　本課題利用野生型小鼠（wt）、miR-144/

12、451基因敲除鼠（miR-144/451-/-，mko）、β地中海貧血雜合子小鼠（βthalassemia heterozygote，βhet）作為體內(nèi)研究對象，通過遺傳學雜交方法將miR-144/451基因敲除的雜合子小鼠與β地中海貧血雜合子小鼠共同飼養(yǎng)雜交，得到miR-144/451基因部分敲除和完全敲除的2種β地中海貧血小鼠模型(mhet/βhet和mko/βhet)（β地中海貧血純合子小鼠是胚胎致死型，所以無存活），通過利用wt

13、、mko、βhet和mko/βhet共4組不同基因型小鼠，進行以下實驗:1）檢測miR-144/451在外周血、骨髓以及小鼠胚胎肝紅細胞中表達趨勢，進一步驗證miR-144/451基因表達缺失后β地中海貧血改善的現(xiàn)象;2）通過體內(nèi)外模型闡明miR-144/451功能缺失后β地中海貧血改善的可能分子機制;3）通過體內(nèi)實驗進一步明確姜黃素在β地中海貧血中發(fā)揮的抗氧化作用，以及姜黃素與miR-144/451在改善β地中海貧血癥狀中的相互關聯(lián)。

14、通過以上實驗，本研究旨在明確miR-144/451與β地中海貧血的關系，闡明miR-144/451缺失后改善β地中海貧血的可能分子機制，并探討姜黃素對β地中海貧血的干預作用，旨在為開發(fā)β地中海貧血及類似重癥貧血的靶向治療提供可靠的體內(nèi)模型及理論依據(jù)，使得β地中海貧血臨床患者受益。研究內(nèi)容分為以下6個部分:
　　第一部分 miR-144/451基因敲除和β地中海貧血雜交小鼠模型的建立
　　目的:通過遺傳學方法繁殖小鼠，并基因型

15、鑒定明確各種小鼠基因型，統(tǒng)計各種基因型小鼠的生存率，明確miR-144/451缺失前后對β地中海貧血小鼠生存率的影響。
　　方法:通過遺傳學方法將wt小鼠與miR-144/451敲除小鼠(miR-144/451-/-，mko)雜交，進行PCR基因型鑒定后得到miR-144/451雜合子小鼠(miR-144/451+/-，mhet)，將mhet小鼠與β地中海貧血雜合子(βhet)小鼠共同飼養(yǎng)，對子代小鼠進行PCR擴增基因型鑒定得到m

16、iR-144/451基因部分敲除和完全敲除的2種β地中海貧血小鼠模型(mhet/βhet和mko/βhet)，然后將親代均為mhet/βhet的雙雜合子小鼠雜交，根據(jù)孟德爾遺傳定律統(tǒng)計子代各種基因型小鼠的存活數(shù)量。
　　結果:通過遺傳學雜交方法得到的所有子代小鼠共2123只小鼠，其中，wt小鼠321只，β地中海貧血(mwt/βhet，βhet)小鼠68只，miR-144/451缺失的β地中海貧血(mko/βhet)小鼠120只，雙

17、雜合子（mhet/βhet）小鼠249只，其中mko/βhet小鼠總的生存數(shù)多于mwt/βhet;將親代基因型均為mhet/βhet的小鼠進行雜交后，統(tǒng)計子代小鼠共541只，其中wt小鼠103只，βhet小鼠33只，mko/βhet小鼠49只，其中mko/βhet小鼠總的生存數(shù)也多于mwt/βhet。
　　結論:與βhet組比較，miR-144/451表達缺失后β地中海貧血小鼠存活率顯著升高。提示miR-144/451可能參與β地

18、中海貧血的發(fā)生發(fā)展，有望作為新的分子標靶干預β地中海貧血的治療及預后。
　　第二部分 miR-144/451在β地中海貧血小鼠體內(nèi)的表達變化
　　目的:明確miR-144/451在β地中海貧血小鼠體內(nèi)的表達情況，為進一步探討miR-144/451對β地中海貧血的作用機制奠定基礎。
　　方法:通過胚胎干細胞富集試劑盒和FCM分選出:1）wt小鼠、βhet小鼠14.5天胚胎肝細胞中的胚胎干細胞;2）兩種基因型小鼠的骨髓有核

19、紅細胞（脫核前）和網(wǎng)織紅細胞（脫核后）;3）β地中海貧血小鼠外周血中的成熟紅細胞及網(wǎng)織紅細胞;提取胚胎肝細胞中的胚胎干細胞、骨髓有核紅細胞和網(wǎng)織紅細胞、外周血紅細胞中的總RNA，進行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并運用qRT-PCR技術檢測miR-144和miR-451的表達情況。
　　結果:與wt小鼠比較，miR-144和miR-451在β地中海貧血小鼠14.5天的胚胎干細胞中表達顯著性升高;miR-144/451在骨髓有核紅細胞及網(wǎng)織紅細

20、胞中的表達均顯著升高;β地中海貧血小鼠外周血紅細胞中miR-144/451的表達也顯著性升高，且網(wǎng)織紅細胞中表達趨勢和成熟紅細胞中一致。
　　結論:miR-144/451在β地中海貧血小鼠紅細胞的不同發(fā)育階段均有顯著性升高，提示miR-144/451參與了β地中海貧血的發(fā)病過程。
　　第三部分 miR-144/451基因表達缺失改善β地中海貧血的作用
　　目的:明確miR-144/451基因缺失表達后對β地中海貧血的影

21、響。
　　方法:通過檢測4組基因型小鼠（wt，mko，βhet，mko/βhet）的外周血細胞參數(shù)，明確各種小鼠貧血情況;制作外周血涂片，并進行瑞氏-吉姆薩染色、網(wǎng)織紅細胞染色液染色、α-沉淀(Heinz body)結晶紫染色、普魯士藍染色等方法，明確4組小鼠外周血中紅細胞形態(tài)、數(shù)量及是否存在鐵沉積的變化;運用流式細胞技術檢測4組小鼠外周血和骨髓中的紅細胞，明確紅細胞的分化成熟度;運用流式細胞儀檢測外周血中網(wǎng)織紅細胞數(shù)量，明確紅細

22、胞成熟度;檢測4種小鼠脾臟的形態(tài)學及組織學變化，明確各組小鼠的代償性造血水平。
　　結果:1）外周血涂片瑞氏-吉姆薩染色結果提示:與βhet組小鼠比較，mko/βhet組小鼠外周血紅細胞形態(tài)明顯改善，紅細胞大小較均勻，靶形紅細胞減少，中心淡染區(qū)減小，網(wǎng)織紅細胞計數(shù)明顯減少;2）網(wǎng)織紅細胞染色結果提示:與βhet組小鼠比較，mko/βhet組小鼠的外周血網(wǎng)織紅細胞染色陽性比例明顯減少;3）α-沉淀(Heinz body)結晶紫染色結

23、果提示:與βhet組小鼠比較，mko/βhet組小鼠的外周血紅細胞中的沉淀明顯減少，有顯著統(tǒng)計學意義;4）普魯士藍染色結果提示，與βhet組小鼠比較，mko/βhet組小鼠的外周血紅細胞中鐵沉積減少;5）流式細胞儀檢測結果提示:與βhet組小鼠比較，mko/βhet組小鼠的外周血中網(wǎng)織紅細胞比例明顯下降，且骨髓及外周血的紅細胞成熟度明顯改善;6)脾臟形態(tài)學及組織學結果提示:與βhet組小鼠比較，mko/βhet組小鼠的脾臟明顯減小，重量

24、顯著性減輕，組織學結果提示脾臟中紅細胞數(shù)量明顯減少，脾臟鐵沉積也明顯改善，提示小鼠體內(nèi)代償性造血功能改善。
　　結論:miR-144/451基因缺失表達后可顯著改善β地中海貧血。說明miR-144/451參與了β地中海貧血紅細胞的成熟過程，可作為新的分子標靶干預紅細胞疾病的治療及預后。
　　第四部分 miR-144/451基因缺失促進Nrf2的轉(zhuǎn)錄活性改善β地中海貧血的分子機制
　　目的:流式細胞儀分選出4種不同基因型

25、小鼠的骨髓有核紅細胞后，進行mRNA芯片;檢測β地中海貧血小鼠外周血中ROS表達，對比4種不同基因型小鼠外周血中的ROS水平，明確miR-144/451缺失表達后ROS水平明顯下降。闡明miR-144通過作用于靶基因Nrf2，間接調(diào)控Nrf2下游各種抗氧化應激酶的表達，明確miR-144/451缺失表達改善β地中海貧血的分子機制。
　　方法:流式細胞儀分選出4種不同基因型小鼠的骨髓有核紅細胞，進行mRNA芯片聚類分析，篩查出在mi

26、R-144/451基因缺失后有顯著表達變化的mRNA。通過眼眶采血得到4種不同基因型小鼠的外周血，DCFH-DA孵育標記后，流式細胞儀檢測外周血紅細胞中的ROS表達;并予以過氧化氫(H2O2)作用紅細胞后檢測ROS;通過生物信息學網(wǎng)站TargetScan及miRbase等數(shù)據(jù)庫的查詢預測miR-144可通過堿基互補特異性結合在Nrf2的3'UTR端;T4克隆構建過表達miR-144/451的MSCV-PIG逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，運用雙熒光素酶

27、報告實驗在293T細胞進一步驗證miR-144與Nrf2的綁定關系，確定Nrf2為miR-144的靶基因;Terl19磁珠抗體分選出不同基因型小鼠的骨髓有核紅細胞，qRT-PCR及Western Blot驗證miR-144在轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后水平對Nrf2表達的影響，應用qRT-PCR檢測Nrf2下游各種抗氧化應激酶包括SOD、Catalase、GPX1、NQO1的表達變化。
　　結果:1）骨髓有核紅細胞mRNA芯片結果聚類分析提示

28、4組不同基因型的mRNA表達有顯著變化;2）流式細胞儀檢測結果提示，與wt小鼠比較，βhet組小鼠ROS水平明顯升高;與βhet組比較，mko/βhet組小鼠的ROS水平顯著下降;3）miR-144可通過特異性堿基互補作用于Nrf2的3'UTR端，從而在翻譯水平上抑制Nfr2的表達;4）與βhet組比較，mko/βhet組小鼠體內(nèi)Nrf2及下游的抗氧化酶SOD、NQO1的相對表達量明顯升高。
　　結論:1）明確β地中海貧血小鼠體內(nèi)

29、氧化應激水平明顯升高，miR-144/451基因缺失后氧化應激水平改善;2）闡明miR-144/451基因缺失表達后可顯著改善β地中海貧血的分子機制:miR-144/451缺失表達后，靶基因Nrf2的表達量及轉(zhuǎn)錄活性升高，引起抗氧化酶包括SOD、NQO1的表達增加;3）為β地中海貧血的靶向治療提供可靠的理論依據(jù)。
　　第五部分 miR-144/451功能缺失促進AHSP表達改善β地中海貧血的分子機制研究
　　目的:明確miR

30、-144/451缺失表達后AHSP表達的變化，進一步闡明miR-144/451可調(diào)控靶基因AHSP的表達，調(diào)節(jié)AHSP與α珠蛋白的結合，減少紅細胞中Heinz Body的沉積，從而驗證miR-144/451功能缺失在改善β地中海貧血的癥狀中的另一可能機制，為開發(fā)β地中海貧血的臨床新治療提供理論依據(jù)。
　　方法:通過生物信息學網(wǎng)站TargetScan及miRbase等數(shù)據(jù)庫的查詢預測miR-144和miR-451成熟系列可通過特異性

31、堿基互補原則分別結合在AHSP的編碼區(qū)及5'UTR端;T4克隆構建過表達miR-144/451的MSCV-PIG逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，并構建含有miR-144/451綁定序列的AHSP和突變了miR-144/451綁定序列的AHSP的PGL3-BS質(zhì)粒載體，運用雙熒光素酶報告實驗在293T細胞中進一步驗證miR-144/451與AHSP的綁定關系，確定miR-144/451可靶向作用于AHSP;體外培養(yǎng)MEL細胞，驗證miR-144/451對

32、AHSP表達的抑制作用;磁珠分選出不同基因型小鼠的骨髓有核紅細胞，qRT-PCR及Western Blot驗證miR-144/451在轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后水平對AHSP的影響，結晶紫染色明確紅細胞中α-沉淀的表達變化。
　　結果:1）miR-144/451可通過特異性堿基互補作用于AHSP的編碼區(qū)及5'UTR端，在翻譯水平上抑制AHSP蛋白的表達;2）與βhet組小鼠比較，mko/βhet組小鼠外周血及骨髓有核紅細胞中AHSP的mRN

33、A表達升高，蛋白表達量也升高;3）與βhet組小鼠比較，mko/βhet組小鼠外周血涂片結晶紫染色提示紅細胞中α沉淀顯著性減少。
　　結論:闡明miR-144/451基因缺失表達后顯著改善β地中海貧血的分子機制:miR-144/451缺失表達后，靶基因AHSP的表達量升高，高表達的AHSP可結合較多的α珠蛋白，減少α珠蛋白在紅細胞膜上的沉淀，紅細胞破壞減少，從而起到改善貧血的作用。這將為進一步開發(fā)針對miR-144/451的小核酸

34、類抑制劑治療β地中海貧血提供又一個可靠的理論依據(jù)。
　　第六部分姜黃素通過調(diào)節(jié)氧化應激善β地中海貧血的研究
　　目的:研究姜黃素（Curcumin，CUR）調(diào)節(jié)氧化應激的作用，探討其改善β地中海貧血的效果，為傳統(tǒng)中醫(yī)中藥治療β地中海貧血提供理論參考。
　　方法:實驗小鼠分為4組，分別為wt，wt+姜黃素，βhet，βhet+姜黃素。參考研究文獻，予以腹腔注射姜黃素（劑量為50 mg/kg）21天后，全血細胞儀測定4組小

35、鼠外周全血細胞計數(shù)，并取外周血DCFH-DA孵育標記后流式細胞儀檢測ROS表達變化，統(tǒng)計4組小鼠脾臟大小形態(tài)的差異;檢測4組小鼠體內(nèi)抗氧化應激酶SOD、NQO1、Catalase和GPX1的表達，明確姜黃素對βhet小鼠抗氧化應激酶的影響;檢測小鼠外周中miR-144/451的表達變化，闡明姜黃素作用的可能機制。
　　結果:1）姜黃素可顯著改善βhet外周血的各項指標，改善小鼠體內(nèi)的代償性造血狀態(tài);2）姜黃素可通過顯著性提高抗氧化

36、酶SOD、NQO1的mRNA表達，降低ROS的水平，緩解氧化應激損傷;3）姜黃素可顯著降低β地中海貧血小鼠脾臟的大小形態(tài)，改善小鼠代償性造血;4）姜黃素可顯著性降低β地中海貧血小鼠外周血及骨髓中的miR-144的表達，對miR-451有降低趨勢，但無統(tǒng)計學差異。
　　結論:1）姜黃素可改善β地中海貧血，改善外周血紅細胞形態(tài);2）姜黃素可改善β地中海貧血脾臟的代償造血狀態(tài);3）姜黃素可降低miR-144/451的表達，并通過促進抗氧