藍(lán)莓缺鐵響應(yīng)機(jī)制研究.pdf

1、藍(lán)莓（Vaccinium spp.），在其它植物能夠正常生長(zhǎng)的條件下仍易出現(xiàn)缺Fe性失綠，即其Fe營(yíng)養(yǎng)代謝具有明顯的低效性，但相關(guān)機(jī)理仍不明確。目前，對(duì)藍(lán)莓Fe營(yíng)養(yǎng)生理的有限報(bào)道表明，藍(lán)莓根系對(duì)Fe的吸收與擬南芥一樣，包括Fe的活化、還原及吸收等環(huán)節(jié)，但不明確上述Fe吸收過程中的限速環(huán)節(jié);另外，調(diào)控藍(lán)莓缺Fe性響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子、以及轉(zhuǎn)錄因子作用的關(guān)鍵靶基因亦尚未明確。本研究擬通過水培方法進(jìn)行缺鐵與非酸性條件試驗(yàn)，再通過多項(xiàng)生理指標(biāo)測(cè)定，并

2、結(jié)合鐵代謝相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量的變化分析，來探討缺鐵與非酸性條件對(duì)藍(lán)莓鐵營(yíng)養(yǎng)代謝的影響。并在分離藍(lán)莓Fe代謝相關(guān)的關(guān)鍵基因FER(Iron deficiency-induced transcription factor,FER)、FRO2(Ferric reduction oxidase2,FRO2)以及IRT1（Iron-regulated transporter1，IRT1）的cDNA全長(zhǎng)的基礎(chǔ)上，構(gòu)建表達(dá)載體，再將其遺傳轉(zhuǎn)化至擬南

3、芥同源基因突變體中，用于分析轉(zhuǎn)基因株系的Fe營(yíng)養(yǎng)生理及缺Fe響應(yīng)機(jī)理，來探討藍(lán)莓Fe低效營(yíng)養(yǎng)的內(nèi)在機(jī)理。這將對(duì)解決生產(chǎn)中藍(lán)莓缺Fe的問題、栽培管理及生物技術(shù)育種發(fā)揮積極的推動(dòng)作用。具體研究結(jié)果如下:
　　缺Fe條件下，首先影響到藍(lán)莓新生葉片F(xiàn)e營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，導(dǎo)致藍(lán)莓葉綠素合成受阻，葉片呈現(xiàn)黃化現(xiàn)象，葉綠素含量降至對(duì)照組的55％左右。當(dāng)根系缺Fe時(shí)，藍(lán)莓根系活力減弱至對(duì)照組的66.7％，根系Fe含量?jī)H為正常供Fe組的33.95％。藍(lán)莓葉

4、和根部FRO活性分別為對(duì)照組的1.26、1.38倍，說明藍(lán)莓仍能應(yīng)激性地提高VcFRO2基因表達(dá)量及蛋白活性。非酸性條件處理下，藍(lán)莓根部出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，且根系活力極顯著下降至對(duì)照組的1/3，而新長(zhǎng)嫩葉出現(xiàn)除葉脈外的黃化現(xiàn)象。
　　qRT-PCR結(jié)果表明，缺鐵情況下VcFER在3個(gè)時(shí)期均出現(xiàn)顯著性上調(diào)的現(xiàn)象，但缺Fe處理10d時(shí)，VcFRO2及VcIRT1表達(dá)量均未顯著提高，表明下游基因VcFRO2、VcIRT1相對(duì)表達(dá)量變化滯后于V

5、cFER;而fer2(Ferritin2，F(xiàn)er2)均出現(xiàn)顯著性下調(diào)，以此降低體內(nèi)儲(chǔ)藏鐵含量;同時(shí)，缺Fe處理20d后，與胞內(nèi)Fe轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因Nramp3(Natural Resistance-Associated Macrophage Protein3，Nramp3)的相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)至4倍以上，該基因上調(diào)將有利于液泡中的鐵往細(xì)胞質(zhì)中運(yùn)輸。而VcHA(H+-ATPase，HA)表達(dá)無(wú)差異，表明缺鐵并不導(dǎo)致藍(lán)莓分泌過多的H+到土壤中。

6、
　　從藍(lán)莓中分離擴(kuò)增到939bp VcFER、1071bp VcIRT1、2106bp VcFRO2的cDNA全長(zhǎng)序列，并構(gòu)建了三個(gè)基因的超表達(dá)載體，用于遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥同源突變體。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，VcFER是屬于HLH超家族的轉(zhuǎn)錄因子，VcFRO2屬于鐵氧環(huán)蛋白還原酶超家族，IRT1是屬于Zip超家族的金屬蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析三個(gè)基因與大多數(shù)物種的親緣關(guān)系不高。分析表明，藍(lán)莓的VcFER、VcIRT1蛋白序列與其它物種

7、存在較大差異性，親緣性不高，有可能是導(dǎo)致其Fe低效營(yíng)養(yǎng)的重要原因。
　　轉(zhuǎn)基因研究表明，Atfit/VcFER陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因擬南芥植株較Atfit突變體植株黃化性狀有較顯著改善，但未完全回復(fù)突變。Atirt/VcIRT1轉(zhuǎn)基因植株顯著改善了突變體的黃化癥狀，主要表現(xiàn)為植株相對(duì)健壯，但到花期其葉片與WT相比仍有出現(xiàn)輕微黃化現(xiàn)象。Atfro/VcFRO2抗性植株出現(xiàn)嚴(yán)重黃化，最終葉片泛白死亡，無(wú)法正常長(zhǎng)大，由此可見，VcFRO2對(duì)三價(jià)鐵離