鈣信號通路在形覺剝奪性近視小鼠視網(wǎng)膜上的作用研究.pdf

1、目的：
　　近視是一種最常見的屈光不正，全球有14億人受其影響，并且其患病率仍在日益地增高。更嚴重的病理性近視，伴有各種眼底并發(fā)癥甚至致盲。近視的發(fā)病機制目前尚不明確，其影響因素主要分為遺傳和環(huán)境兩大因素。在遺傳方面，本課題組前期通過全基因組重測序技術(shù)（病理性近視核心家系）和全基因組關(guān)聯(lián)分析（散發(fā)的病理性近視）以及獨立大樣本重復(fù)驗證，提示電壓依賴性鈣通道可能參與了病理性近視的發(fā)生發(fā)展；在環(huán)境方面，通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)（RNA-Seq

2、）發(fā)現(xiàn)形覺剝奪（FD）2天及4周視網(wǎng)膜上存在大量的差異基因，并在鈣信號通路明顯富集，提示鈣信號通路可能與近視相關(guān)。但目前仍未有關(guān)于鈣信號通路與近視相關(guān)的文獻報道。本實驗主要通過探討電壓依賴性鈣通道（VDCCs）在形覺剝奪性近視（FDM）小鼠視網(wǎng)膜中的作用，以明確鈣信號通路在近視發(fā)生發(fā)展過程中的作用以及機制，進一步闡明近視的發(fā)病機制。
　　方法：
　　選取3周齡C57BL/6小鼠作為實驗動物。（1）單純形覺剝奪實驗：經(jīng)過屈光篩

3、選后隨機分為形覺剝奪（FD）組和正常對照（NC）組。分別單眼形覺剝奪造模2天及2周后，通過Real-time PCR檢測視網(wǎng)膜上CACNA1B、CACNA1D以及其他鈣通道易感基因 mRNA水平的變化；通過流式細胞技術(shù)檢測視網(wǎng)膜細胞內(nèi)鈣離子水平變化；以及通過IF檢測鈣信號通路下游分子p-CaMKⅡ蛋白水平的變化。（2）干預(yù)實驗:①L-VDCCs拮抗劑尼莫地平（Nimodipine）干預(yù)實驗：將實驗小鼠隨機分為正常屈光組和FD組，其中正常

4、屈光的藥物組連續(xù)兩周腹腔注射1 mg/kg尼莫地平，溶劑組注射20％ DMSO作為對照；形覺剝奪組的所有小鼠均給予單眼形覺剝奪，藥物組同樣連續(xù)兩周腹腔注射1 mg/kg尼莫地平，溶劑組予以注射20%DMSO作為對照。實驗前后分別通過EIR、OCT進行屈光度眼軸等生物學(xué)參數(shù)的測量，實驗結(jié)束后通過IF檢測p-CaMKⅡ、p-creb蛋白水平變化。②視網(wǎng)膜下注射rAAV-shRNA表達載體特異性敲減CACNA1B實驗：將實驗小鼠隨機分為正常對

5、照組（ NC組）、對照組（ Scramble組）和實驗組（CACNA1B-KD組），CACNA1B-KD組給予視網(wǎng)膜下腔注射rAAV2/8-shRNA-CACNA1B，Control組視網(wǎng)膜下腔注射rAAV-shRNA-scramble，NC組不作處理。在實驗開始及注射病毒2天、4周后分別通過EIR、OCT進行屈光度眼軸等生物學(xué)參數(shù)的測量，以及進行ERG檢測和眼底拍照。實驗結(jié)束后通過RT-PCR、IF檢測視網(wǎng)膜CACNA1B mRNA和

6、蛋白水平。
　　結(jié)果：
　　1、單純形覺剝奪后，不論短期剝奪（FD2 d），還是長期剝奪（FD2 w、4 w），編碼鈣離子通道α2δ亞基的CACNA2D1和CACNA2D3的處理眼T眼mRNA水平與對側(cè)眼F眼和NC眼相比均無明顯變化；而編碼N-VGCCs（CaV2.2）和L-VGCCs中CaV1.3的CACNA1B和CACNA1D在短期剝奪（2 d）時mRNA水平T眼、F眼相對NC眼升高，延長剝奪時間（FD1 w、2 w）后

7、，T眼、F眼相對NC眼mRNA水平降低；而編碼L-VGCCs中CaV1.1的CACNA1S在短期剝奪時無明顯變化，長期剝奪時T眼相對F眼上調(diào)。IF檢測視網(wǎng)膜鈣信號通路下游的分子 p-CaMKⅡ無明顯變化。流式檢測全視網(wǎng)膜細胞內(nèi)鈣離子濃度在形覺剝奪2d、2w均無明顯變化。
　　2、藥物干預(yù)實驗中，正常屈光的藥物組與溶劑組相比屈光并無明顯差異，形覺剝奪的藥物組無論是腹腔注射1次/天還是2次/天，1 mg/kg的尼莫地平使其屈光相比溶劑

8、組向近視方向進展1D左右，而無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　3、視網(wǎng)膜下腔注射病毒實驗，CACNA1B-KD組注射眼與Scramble組注射眼相比，CACNA1B mRNA并無明顯的降低，而IF顯示CaV2.2明顯減少。實驗2 w、4 w后CACNA1B-KD組T眼相比Scramble組T眼屈光明顯向近視方向進展，眼軸延長。
　　結(jié)論：
　　1、在形覺剝奪過程中，視網(wǎng)膜CACNA1B和CACNA1D的mRNA在短期剝奪時上調(diào)，長期