血管緊張素Ⅱ及其受體在哮喘氣道重塑中的作用及機制探討.pdf

1、第一部分 血管緊張素Ⅱ及其受體在哮喘大鼠肺組織的表達及其與氣道炎癥和重塑的關系 目的：了解血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)及其受體在哮喘大鼠肺組織的表達及其與哮喘氣道炎癥和氣道重塑的關系。 方法：隨機將20只Wistar大鼠分為對照組和哮喘組兩組，每組10只。采用OVA腹腔注射致敏、長時間反復OVA霧化吸入復制慢性哮喘動物模型。觀察大鼠哮喘發(fā)作癥狀；應用動物肺功能儀測定大鼠氣道反應性(以呼氣相氣道阻力(Re)表示)；支氣

2、管肺泡灌洗液(BALF)作細胞總數(shù)、分類計數(shù)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測BALF上清中TGF-β1、PDGF、VEGF含量；放射免疫分析法(RIA)檢測BALF上清中AngⅡ水平；常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色觀察大體組織病變和炎癥細胞浸潤；免疫組織化學檢測α-SMA染色陽性細胞；應用圖像分析軟件測量大鼠氣道形態(tài)學變化。逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測肺組織血管緊張素Ⅱ受體(AGTR)mRNA表達；蛋白質印跡分析(West

3、ern blot analysis)AGTR和STAT-3蛋白水平。 結果：與對照組相比，哮喘組BALF中細胞總數(shù)以及中性粒細胞和嗜酸性粒細胞比例增加(p<0.05)，BALF中TGF-β1、PDGF、VEGF含量明顯增高(p<0.05～<0.01)；哮喘組較對照組呼氣阻力(Re)明顯增高(P<0.05～0.01)；在小氣道水平，哮喘組氣道管壁面積/管腔內周長(WAt/Pi)、管壁平滑肌面積/管腔內周長(WAm/ Pi)和α-S

4、MA陽性細胞面積/Pi均明顯大于對照組(P均<0.01)。同時，哮喘組BALF中AngⅡ含量高于對照組，哮喘大鼠肺組織AngⅡ受體(AGTRl，AGTR2)mRNA表達和蛋白水平明顯增強(p<0.01)；肺組織STAT3蛋白表達水平在哮喘組明顯增高(p<0.01)。大鼠BALF中細胞總數(shù)與Ang Ⅱ含量和肺組織AGTRlmRNA表達水平呈正相關，r=0.523、0.724，P<0.05-0.01；大鼠小氣道Wat/Pi與肺組織AGTRl

5、 mRNA表達水平呈正相關，r=0.671，P<0.05。 結論：大鼠肺組織局部存在血管緊張素系統(tǒng)，Ang II及其受體可能參與了哮喘氣道炎癥和氣道重塑。 第二部分血管緊張素1I受體拮抗劑對哮喘大鼠氣道炎癥及氣道重塑的影響 目的：觀察血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑纈沙坦對哮喘大鼠氣道炎癥及氣道重塑的影響。 方法：隨機將50只Wistar大鼠分為對照組、哮喘組、纈沙坦干預組C1、C2、C3組，共5組，纈沙坦干預組(

6、C1、C2、C3組)和哮喘組予OVA致敏和霧化吸入，霧化吸入隔天1次×30天，C1、C2、C3組分別于每次霧化吸入前60 min予纈沙坦15 mg·kg-1·d-1、30 mg·kg-1·d-1、50 mg·kg-1·d-1灌胃。動物肺功能儀測定大鼠氣道反應性；BALF作細胞分類計數(shù)；ELIsA檢測BALF上清中TGF-β1、PDGF、VEGF含量;RIA檢測BALF上清中AngⅡ水平；免疫組織化學檢測α-SMA染色陽性細胞；圖像分析軟

7、件測量大鼠氣道形態(tài)學變化。 結果：纈沙坦明顯降低哮喘大鼠BALF中細胞總數(shù)以及中性粒細胞和嗜酸性粒細胞比例(P<0.05～<0.01)，減少BALF中TGF-β1、PDGF、VEGF含量(P<0.05～<0.01)；纈沙坦干預各組氣道反應性明顯低于哮喘組(p<0.05～<0.01)；纈沙坦干預組的C2和C3組WAt/Pi較哮喘組明顯減少(p<0.05)；纈沙坦干預各組(C1、C2、C3組)α-SMA陽性面積/Pi在中、小氣道明顯

8、低于哮喘組(P<0.05～0.01)。但BALF上清中Ang II水平隨纈沙坦劑量增加而升高。 結論：血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑纈沙坦可能具有抑制哮喘氣道炎癥和氣道重塑作用。 第三部分纈沙坦對哮喘大鼠肺組織血管緊張素Ⅱ及其受體表達的影響 目的：觀察血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑纈沙坦對哮喘大鼠肺組織中血管緊張素Ⅱ及其受體表達的影響。 方法：隨機將50只Wistar大鼠分為對照組、哮喘組、纈沙坦干預組C1、C2、C3組

9、，共5組，纈沙坦干預組(C1、C2、C3組)和哮喘組予OVA致敏和霧化吸入，霧化吸入隔天1次×30天，C1、C2、C3組分別于每次霧化吸入前60 min予纈沙坦15 mg·kg-1·d-1、30 mg·kg-1·d-1、50 mg·kg-1·d-1灌胃。RIA檢測BALF上清和血清中AngⅡ含量；RT-PCR檢測肺組織TGF-β1mRNA、VEGF rnRNA、AGTRl mRNA和AGTR2 mRNA表達；Western Blot A

10、nalysis檢測AGTR和STAT3蛋白水平；原位雜交法檢測AGTR1和ATGR2 mRNA在肺組織中分布和表達。 結果：纈沙坦干預組的C2組、C3組AngⅡ高于對照組和哮喘組，尤以C3組增高最為明顯(p<0.01)。哮喘組AGTR1 mRNA表達明顯高于對照組(p<0.01)，而纈沙坦干預組(C1、C2、C3組)AGTRl mRNA表達低于哮喘組(p<0.01)；對照組和C1組AGTR2 mRNA表達明顯低于哮喘組，C2、C

11、3組AGTR2 mRNA表達高于對照組和C1組，但明顯低于哮喘組(p<0.05～0.01)。Western blot分析顯示AGTR1蛋白水平結果與AGTRl mRNA一致(P<0.01)，但AGTR2蛋白水平在對照組和C1組未檢測到，哮喘組AGTR2蛋白水平增高，C2、C3組AGTR2蛋白水平低于哮喘組(p<0.05)。原位雜交法檢測顯示AGTRlmRNA表達在哮喘組明顯強于對照組和纈沙坦干預組，AGTR2mRNA在哮喘組和纈沙坦干預

12、組C3的表達明顯強于對照組和纈沙坦干預組C1、C2。哮喘組TGF-β1 mRNA和VEGF mRNA明顯高于對照組(p<0.01)，纈沙坦干預組(C1、C2、C3組)兩者的表達則低于哮喘組(p<0.01)。哮喘組STAT3蛋白表達明顯高于對照組(P<0.01)，纈沙坦干預組(C1、C2、C3組)STAT3低于哮喘組(p<0.01)。哮喘大鼠肺組織AGTRl mRNA表達隨纈沙坦劑量增大而減弱，與纈沙坦劑量呈負相關，r=-0.775，P<

13、0.01。 結論：Ang Ⅱ通過AGTRl參與哮喘氣道炎癥和氣道重塑，刺激細胞因子TGF-β1、VEGF、PDGF和信號分子STAT3分泌和表達可能是其部分作用機制。纈沙坦通過阻斷AGTRl減輕哮喘的氣道病變，其部分機制可能與纈沙坦下調AGTRl表達，降低AngⅡ生物學效應，引起反應性Ang Ⅱ濃度升高有關，高水平的Ang Ⅱ激動了AGTR2，使AGTR2表達上調，產生潛在的氣道保護作用。 第四部分血管緊張素Ⅱ對人體氣道

14、平滑肌細胞增殖的影響及纈沙坦的干預 目的：觀察Ang Ⅱ對人體氣道平滑肌細胞(HASMC)增殖的影響以及纈沙坦的抑制作用。 方法：體外原代培養(yǎng)HASMC，傳代后給予不同濃度Ang Ⅱ和組織胺(His)刺激，用纈沙坦對AngⅡ和His作用的HASMC進行干預。以四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測細胞增殖能力，流式細胞術(FCM)測定細胞周期和caspase-3表達。 結果：(1)MTT法顯示，AngⅡ組的吸光度(A57

15、0)和生長率明顯高于對照組和纈沙坦單藥組，以Ang Ⅱ10-5mol/L濃度在第24h為明顯(p<0.01)。AngⅡ+纈沙坦組的A570和生長率明顯低于AngⅡ組，纈沙坦的抑制作用在第24h時最為明顯(p<0.01)，且表現(xiàn)一定的濃度依賴關系，以纈沙坦10-3mol/L的抑制作用最為明顯。(2)FCM分析，與對照組相比較，Ang Ⅱ10-5mol/L組和His10-2 mol/L組的S期百分率明顯升高(p<0.05～0.01)；Ang

16、 Ⅱ+纈沙坦組與Ang Ⅱ組相比，S期百分率呈劑量依賴性降低(p<0.05)，可以看出纈沙坦抑制AngⅡ誘導的HASMC增殖；His+纈沙坦組與His組相比，顯示了和AngⅡ+纈沙坦組與AngⅡ組類似的結果(p<0.05～0.01)，提示纈沙坦也可以抑制His誘導的HASMC增殖。(3)AmgⅡ+纈沙坦組caspase-3蛋白表達強于Amg Ⅱ組。 結論：AngⅡ＃fHASMC有刺激增殖作用，纈沙坦對AngⅡ誘導的HASMC增殖