核仁素在血管新生中的作用及其機(jī)制初步探討.pdf

1、血管新生是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，但其具體機(jī)制目前尚未完全明了。核仁素是一種具有多種生物學(xué)功能，在真核生物中高度保守的核仁磷酸蛋白，也是一種重要的RNA結(jié)合蛋白，具有在核仁、胞核、胞漿，甚至細(xì)胞膜表面穿梭的特性。大量研究表明，細(xì)胞膜表面核仁素參與血管新生的調(diào)節(jié)。然而，核仁素的RNA結(jié)合特性在血管新生中有何作用，目前仍不清楚。本研究在明確核仁素對血管新生起調(diào)節(jié)作用后，擬初步探討其RNA結(jié)合特性在血管新生中的作用及其可能的機(jī)制。
　　本

2、實(shí)驗(yàn)首先通過建立小鼠心肌缺血模型，利用免疫組化和免疫熒光技術(shù)觀察血管新生和核仁素的表達(dá)，并采用PCR和WesternBlot技術(shù)檢測血管新生相關(guān)基因和核仁素的表達(dá)。其次，在細(xì)胞水平，建立VEGF誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)發(fā)生細(xì)胞遷移和管型形成的模型，采用增加和降低核仁素表達(dá)的研究手段，探討核仁素在VEGF誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和管型形成中的作用;同時(shí)利用PCR和WesternBlot技術(shù)觀察血管新生相關(guān)基因的表達(dá)情況。最后利用蛋白質(zhì)-

3、RNA免疫共沉淀技術(shù)探討血管新生中核仁素可能調(diào)控的相關(guān)靶基因，以闡明核仁素在血管新生中發(fā)揮作用的可能機(jī)制。
　　主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.整體動物實(shí)驗(yàn)。
　　(1)免疫組化和免疫熒光分析發(fā)現(xiàn):心肌缺血后15天，缺血組心肌組織中核仁素和血管內(nèi)皮鈣粘蛋白表達(dá)升高，與假手術(shù)組比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　(2)PCR和WesternBlot技術(shù)檢測顯示:缺血組心肌組織中核仁素和血管新生相關(guān)基因表達(dá)升高，與假手術(shù)組比，差異

4、具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　(3)HE染色顯示核仁素轉(zhuǎn)基因小鼠血管密度明顯增高，免疫組化、PCR和WesternBlot技術(shù)檢測顯示血管新生相關(guān)基因表達(dá)升高，與野生型小鼠相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。
　　(1)PCR和WesternBlot技術(shù)檢測顯示VEGF可誘導(dǎo)HUVEC核仁素表達(dá)升高，并在一定程度上呈時(shí)間和濃度依賴性。
　　(2)核仁素過表達(dá)能促進(jìn)VEGF誘導(dǎo)的HUVEC發(fā)生細(xì)胞遷移和管型形成;

5、反之，siRNA介導(dǎo)的核仁素低表達(dá)則能抑制VEGF誘導(dǎo)的HUVEC發(fā)生細(xì)胞遷移和管型形成。
　　(3)生物信息學(xué)分析顯示多個血管新生相關(guān)基因如VE-cadherin，Tie-2，MMP9，Endoglin，COX43等的mRNA含有一個或多個核仁素的結(jié)合元件。
　　(4)PCR和WesternBlot技術(shù)檢測顯示siRNA介導(dǎo)的核仁素低表達(dá)能抑制血管新生相關(guān)基因的表達(dá)。
　　(5)利用蛋白質(zhì)-RNA免疫沉淀技術(shù)，發(fā)現(xiàn)核