超積累東南景天轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析與ZIP家族基因功能研究.pdf

1、鎘是一種生物毒性極強的金屬元素。環(huán)境中，尤其是土壤中的鎘極易被植物吸收，進而通過食物鏈逐級富集，嚴(yán)重危及人體健康。超積累生態(tài)型(HE)東南景天是一種原生于我國的鎘超積累植物，它能夠在地上部累積超過5，000 mg/kg的鎘而不表現(xiàn)出明顯的毒害癥狀，是一種較為理想的生物修復(fù)材料。對東南景天鎘超積累機制，尤其是分子機制的深入研究有助于揭示植物體金屬穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，挖掘鎘超積累關(guān)鍵基因，為創(chuàng)新植物修復(fù)材料提供基因素材。過往在東南景天上開展的研究

2、多集中在生理層面，由于缺乏基因組序列信息，對這些生理過程背后所蘊含生化機制的研究進展相對滯后，成為東南景天超積累機制研究中的短板。鑒于此，本研究綜合利用二代測序技術(shù)Roche454平臺和Illumina/Solexa平臺測定并構(gòu)建了HE東南景天地上部轉(zhuǎn)錄組序列信息;并以此為基礎(chǔ)，研究HE東南景天地上部轉(zhuǎn)錄組對鎘脅迫的響應(yīng);從中選取代表性的基因，利用實時熒光定量PCR(q-RT-PCR)技術(shù)，分別對比研究超積累與非超積累生態(tài)型（NHE）東

3、南景天中所選基因在正常生長及鎘處理條件下的響應(yīng)差異，以期揭示東南景天地上部鎘超積累的分子機制。
　　 此外，本研究還從轉(zhuǎn)錄組序列數(shù)據(jù)庫中選取ZIP家族基因為例，綜合利用cDNA末端快速擴增技術(shù)(RACE)、q-RT-PCR、酵母功能互補實驗及生物信息學(xué)分析方法克隆得到3個ZIP基因，并初步研究了其基因特性與功能。具體研究結(jié)果如下:
　　 1.利用Roche454和Illumina/Solexa平臺測定并構(gòu)建了HE東南景天

4、地上部轉(zhuǎn)錄組序列信息。在Roche454平臺上共獲得135，894條平均長度為286bp的高質(zhì)量測序讀長;在Illumina/Solexa測序平臺上獲得4，750余萬條，總計9.4 Gb的序列信息。以Roche454測序結(jié)果作為拼裝骨架，結(jié)合Illumina/Solexa平臺的海量數(shù)據(jù)構(gòu)建HE東南景天地上部轉(zhuǎn)錄組序列信息，共拼裝得到57，162條長于200bp的Contigs。利用蛋白數(shù)據(jù)庫，對其中的編碼基因進行功能注釋。根據(jù)GO分析，

5、這些基因主要涉及代謝、生物大分子代謝、生物合成等生理過程，參與結(jié)合、催化、蛋白結(jié)合等分子功能。代謝通路分析表明，所拼裝得到的Contigs主要涉及生物體內(nèi)37條代謝通路，其中與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的高達6，695條，占總數(shù)的11.7％。另有671條Contigs參與編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，包括鋅指蛋白(16.3％)、MYB(16.2％)、bHLH(12.5％)和bZIP(8.3％)家族等;
　　 2.對所構(gòu)建的HE東南景天地上部轉(zhuǎn)錄組序列進行

6、生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明，HE東南景天與已完成全基因組測序的物種序列相似度較低，與模式植物擬南芥的相似度不足40％，親緣關(guān)系較遠。利用生物信息學(xué)軟件，在HE東南景天的轉(zhuǎn)錄組中找到6，176條較理想的簡單重復(fù)序列(SSR)，為構(gòu)建東南景天分子標(biāo)記提供了豐富素材。對景天酸代謝關(guān)鍵基因磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)的分析表明，HE東南景天兼有C3和景天酸代謝(CAM)型PEPC特征;
　　 3.對比加鎘處理與對照條件下HE東南景天地

7、上部轉(zhuǎn)錄組的表達變化差異，發(fā)現(xiàn)有110條Contigs表達顯著上調(diào)，另有123條Contigs表達被抑制。利用q-RT-PCR對代表性基因的表達水平進行驗證，與Solexa測序結(jié)果一致，表明Solexa法測得的基因表達數(shù)據(jù)具有較高的可靠性。在基因表達水平發(fā)生顯著變化的Contigs中，大多為功能未知基因，尤其是表達受抑的Contigs中，近一半功能未知。將其余基因進行富集分析，按照GO分類，主要涉及細胞外空間，氨基酸及其衍生物代謝，催化

8、活性與大分子代謝;按照代謝通路分類，則主要與次生代謝物合成，能量代謝，代謝病及位于膜上的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)等相關(guān)。以富集分析結(jié)果為依據(jù)，并結(jié)合基因功能注釋，可知鎘誘導(dǎo)下表達顯著上調(diào)的Contigs主要參與了植物體細胞壁合成、沉積與修飾，金屬螯合物合成、金屬離子及其配合物轉(zhuǎn)運，抗氧化及基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)四大類生理過程;
　　 4.以HE與NHE東南景天為試驗材料，利用q-RT-PCR法對比研究鎘超積累/耐性相關(guān)基因在兩種生態(tài)型東南景天地上部的表

9、達差異。參照鎘誘導(dǎo)條件下HE東南景天地上部轉(zhuǎn)錄組響應(yīng)情況及相關(guān)文獻，選取了與細胞壁合成、修飾，抗氧化，金屬轉(zhuǎn)運，金屬螯合物合成等相關(guān)的18個基因，以HE東南景天地上部序列信息為依據(jù)設(shè)計引物，用PCR法在非超積累植物上進行擴增，結(jié)果表明，所設(shè)計引物均能在兩種生態(tài)型東南景天上特異擴增。以植物體內(nèi)過氧化物酶基因的表達水平為依據(jù)，確定5μM鎘處理下，NHE東南景天地上部中鎘的脅迫水平與HE東南景天在100μM鎘處理下的脅迫水平相當(dāng)。對比研究兩種

10、生態(tài)型東南景天在相似鎘脅迫條件下的基因表達差異，結(jié)果顯示，漆酶，肉桂酸羥化酶及Nramp2基因在HE中的表達水平要高于NHE，而Nramp3，HMA4和YSL3則是在NHE中顯著誘導(dǎo)。纖維素合成酶與S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因在HE中表達上調(diào)，而在NHE中表達被抑制。進一步對比研究正常生長狀況下兩種生態(tài)型東南景天地上部的基因表達，結(jié)果顯示大多數(shù)與金屬轉(zhuǎn)運、細胞壁合成及修飾相關(guān)的基因在正常生長條件下，其在HE內(nèi)的表達水平要組成性地高于NHE

11、東南景天;
　　 5.以HE東南景天轉(zhuǎn)錄組序列為依據(jù)，根據(jù)功能注釋，從中選擇表達豐度較高的ZIP家族基因片斷Sa_contig615、contig3033和Sa_contig22157，利用RACE方法克隆全長，發(fā)現(xiàn)Sa_contig3033的全長序列與AtZIP1序列相似度較高，故命名為SaZIP1;相似地，將Sa_contig615和Sa_contig22157全長序列分別命名為SaZIP4與SaZIP11。拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測表明