小麥基因組中WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因鑒定、克隆和TaWRKY10基因的功能分析.pdf

1、逆境因素包括干旱、高鹽和低溫等,是全球范圍內(nèi)造成作物產(chǎn)量減少和質(zhì)量下降的主要原因。為對抗越來越嚴(yán)峻的環(huán)境氣候條件,植物進(jìn)化出了非常復(fù)雜的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來調(diào)控形態(tài)和生理上的變化,以適應(yīng)各種不良環(huán)境。這些調(diào)控通常是通過感受外界刺激,從而激活或者抑制基因的轉(zhuǎn)錄而實(shí)現(xiàn)的。轉(zhuǎn)錄因子在響應(yīng)環(huán)境信號變化,調(diào)控基因表達(dá)變化中起重要作用。WRKY是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子,雖然大量的研究表明WRKY轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與植物對多種逆境脅迫的調(diào)節(jié),但其多數(shù)成員在植物

2、對非生物逆境脅迫響應(yīng)過程中的分子機(jī)制還不十分清楚。小麥?zhǔn)侨祟惖闹饕Z食作物和牲畜飼料,但由于其屬于異源六倍體,基因組結(jié)構(gòu)異常復(fù)雜,至今小麥中有關(guān)WRKY的研究報道很少?？紤]到WRKY轉(zhuǎn)錄因子在復(fù)雜的環(huán)境條件下的多重作用,小麥基因組中WRKY基因家族的鑒定、克隆及其成員生物學(xué)功能的研究是一項(xiàng)非常有挑戰(zhàn)的工作。
　　本研究旨在初步分析小麥基因組中WRKY家族組成的基礎(chǔ)上,探索WRKY是否能夠賦予植物對非生物逆境脅迫的耐受性,以及小麥W

3、RKY基因賦予植物對非生物脅迫的耐受性的生理和分子機(jī)制。我們首先在數(shù)據(jù)庫中搜索WRKY結(jié)構(gòu)域的基礎(chǔ)上,成功克隆了其中10個WRKY候選基因。通過分析了小麥模式品種中國春(TriticumaestivumL.cv.ChineseSpring)中WRKY基因家族與非生物脅迫的關(guān)系,進(jìn)一步利用遺傳學(xué)、生理學(xué)及生物化學(xué)和分子生物學(xué)的方法研究了其中一個成員——TaWRKY10在非生物脅迫中的功能和作用機(jī)制。本研究取得的主要研究結(jié)果如下:
　

4、　經(jīng)過在DFCI數(shù)據(jù)庫和小麥基因組數(shù)據(jù)庫中對WRKY保守序列的搜索,我們從小麥葉片中分克隆到了10個WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因的全長cDNA序列,分別命名為TaWRKY1-TaWRKY10。這10個WRKY轉(zhuǎn)錄因子均含有保守的WRKY結(jié)構(gòu)域和鋅指結(jié)構(gòu)。進(jìn)化分析結(jié)果顯示,這10個WRKY轉(zhuǎn)錄因子分屬于3個亞類:TaWRKY4,8和9屬于第一亞類,TaWRKY1,2,3,6和10屬于第二亞類,TaWRKY5和7屬于第三亞類。
　　小麥TaW

5、RKY10轉(zhuǎn)錄因子基因cDNA全長為791bp(GenBank編號:HQ700327),包括一個672bp的開放閱讀框,編碼的TaWRKY10蛋白含有223個氨基酸,預(yù)測的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為24.5kDa。多重序列比對結(jié)果顯示,TaWRKY10蛋白包含一個保守的60個氨基酸的DNA結(jié)合域(WRKY結(jié)構(gòu)域)和一個鋅指結(jié)構(gòu)(C-X4-C-X23-H-X-H)。TaWRKY10與其它已報道的WRKY蛋白,如大麥和玉米中的WRKY蛋白具有較近

6、的親緣關(guān)系。
　　器官差異表達(dá)分析表明,TaWRKY10基因在葉中表達(dá)量較高,在根中的表達(dá)量則較低。TaWRKY10基因的表達(dá)能夠顯著受到滲透、低溫和高鹽脅迫、和雙氧水誘導(dǎo)上調(diào)。SouthernBlot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,TaWRKY10基因在六倍體小麥基因組中是以三個拷貝的形式存在的。TaWRKY10-GFP融合蛋白經(jīng)基因槍轟擊至洋蔥表皮細(xì)胞,熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示,綠色熒光和細(xì)胞核特異性染料DAPI影像能夠完全融合,表明TaWRKY

7、10-GFP定位在細(xì)胞核中。酵母轉(zhuǎn)錄激活實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,報告基因His和LacZ可以被TaWRKY10全長和N端區(qū)域激活,這表明TaWRKY10是一個有轉(zhuǎn)錄激活活性的轉(zhuǎn)錄因子,并且其轉(zhuǎn)錄激活位點(diǎn)位于其N端。
　　將TaWRKY10基因克隆到pSN1301植物表達(dá)載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法成功獲得了轉(zhuǎn)基因煙草株系。T2代轉(zhuǎn)基因煙草表型分析結(jié)果表明,過表達(dá)TaWRKY10能夠增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因煙草對滲透和高鹽脅迫的耐受能力。具體表現(xiàn)為:在滲

8、透和高鹽脅迫處理?xiàng)l件下,與野生型比較過表達(dá)TaWRKY10基因煙草幼苗具有較高的種子萌發(fā)率和較長的根長;轉(zhuǎn)基因煙草幼苗在控水處理3周或高鹽處理3周后比野生型煙草具有更高的存活率、相對含水量、脯氨酸含量和可溶性糖含量,同時具有更低的黃葉率和丙二醛含量。超氧陰離子和雙氧水的組織定位染色結(jié)果表明,TaWRKY10基因過表達(dá)在干旱和高鹽處理下都能夠降低煙草植株體內(nèi)的超氧陰離子和雙氧水的積累。滲透脅迫相關(guān)基因表達(dá)分析表明,在正常生長條件下,NtE

9、RD10C、NtSPSA和NtGPX基因的表達(dá)量在轉(zhuǎn)TaWRKY10基因煙草植株中顯著高于野生型。
　　為了進(jìn)一步研究TaWRKY10基因在小麥中的功能,我們將TaWRKY10基因克隆到pAHC25植物表達(dá)載體,利用基因槍轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化小麥鄭麥9023,經(jīng)過PCR法和WesternBlot發(fā)鑒定證實(shí),已成功獲得了過表達(dá)TaWRKY10基因的轉(zhuǎn)基因小麥株系,現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因小麥后代繁育工作還在進(jìn)行中。
　　以上結(jié)果表明,TaWRKY1