蘇云金芽胞桿菌γ-氨基丁酸代謝旁路相關(guān)基因簇的結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、蘇云金芽胞桿菌 (Bacillus thuringiensis,簡稱Bt) 因其殺蟲效果好、安全、高效等優(yōu)點而成為農(nóng)業(yè)生物防治上應(yīng)用最為廣泛的殺蟲微生物.Bt與其它芽胞桿菌相比,一個顯著特點就是在形成芽胞的同時,還能產(chǎn)生由殺蟲蛋白組成的伴胞晶體.有關(guān)Bt伴胞晶體形成機(jī)制方面的研究主要是集中在殺蟲晶體蛋白基因的表達(dá)調(diào)控上,而從代謝調(diào)控的角度研究晶體蛋白形成的分子機(jī)制目前尚未見報道.本論文圍繞蘇云金芽胞桿菌中與γ-氨基丁酸代謝旁路相關(guān)基因簇

2、的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了一系列的研究,主要內(nèi)容包括: 本研究從國內(nèi)分離得到的蘇云金芽胞桿菌G03菌株中克隆了gabT 和 gabD 基因,并分別在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)和純化.酶活測定結(jié)果表明,GabT和GabD蛋白分別呈現(xiàn)出γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶和琥珀酸半醛脫氫酶的活性.氨基酸序列同源性比對分析發(fā)現(xiàn),這兩個蛋白質(zhì)在蠟樣芽胞桿菌群(B.cereus group)中具有較高的相似性,而與枯草芽胞桿菌的相似性較低,分別為58﹪、51﹪.

3、 利用基因敲除技術(shù)分別構(gòu)建了Bt HD-73菌株的gabT、gabD基因缺失突變株,同時也構(gòu)建了相應(yīng)的回復(fù)突變株,對gabT、gabD基因的功能進(jìn)行了研究,結(jié)果表明:gabT、gabD基因敲除不會影響突變株在豐富培養(yǎng)基中的正常生長,但在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(含0.2﹪GABA)中g(shù)abT基因缺失突變株的生長會受到抑制:gabT、gabD基因敲除對晶體蛋白的表達(dá)量無顯著影響,但gabT的缺失會推遲晶體蛋白的表達(dá):gabT、gabD基因敲除均會導(dǎo)致芽

4、胞產(chǎn)量的降低;GABA代謝旁路的功能還有待于進(jìn)一步了解. 通過對Bt HD-73菌株gab基因簇的克隆及序列分析發(fā)現(xiàn),gab基因簇的結(jié)構(gòu)與大腸桿菌和枯草芽胞桿菌的明顯不同,而在蠟樣芽胞桿菌群中基本上是一致的,說明γ-氨基丁酸代謝途徑相關(guān)的基因簇結(jié)構(gòu)在蠟樣芽胞桿菌群中是比較保守的.通過RT-PCR.轉(zhuǎn)錄分析發(fā)現(xiàn)gabD和gabT基因并未同時進(jìn)行轉(zhuǎn)錄,其中g(shù)abT單獨轉(zhuǎn)錄,而gabD與其上游的轉(zhuǎn)錄激活因子編碼基因reg共轉(zhuǎn)錄.根據(jù)克

5、隆并測序的gab基因簇序列,分別克隆了gabT和reg基因的啟動子,并構(gòu)建了相應(yīng)的lacZ融合表達(dá)載體.通過β-半乳糖苷酶活性的定性和定量分析,表明gabT和reg基因的轉(zhuǎn)錄都是由自身的啟動子調(diào)控的.以上研究結(jié)果表明gabT'和gabD基因?qū)儆诓煌霓D(zhuǎn)錄單元,而gabD和reg基因組成了一個操縱子. 利用敲除載體pMADDreg通過同源重組方法敲除reg基因后獲得缺失突變株HD-73(△reg).發(fā)現(xiàn)突變菌株的生長、產(chǎn)芽胞和晶體

6、蛋白的能力與出發(fā)菌株相比并無明顯差異.但reg基因的缺失嚴(yán)重地影響了SSADH酶活性,并通過其回復(fù)突變株恢復(fù)了SSADH酶活性,說明reg基因?qū)abD基因的表達(dá)起正調(diào)控作用.同樣地,發(fā)現(xiàn)reg 基因?qū)abT基因的表達(dá)也起正調(diào)控作用.通過對reg基因的表達(dá)產(chǎn)物Reg蛋白的結(jié)構(gòu)域分析,推測它可能是一種依賴丁σ<'54>因子的激活蛋白,在蠟樣芽胞桿菌群中比較保守,有關(guān)其調(diào)控作用需進(jìn)一步的驗證. 總之,本研究為深入研究蘇云金芽胞桿菌