副溶血性弧菌中密度感應系統(tǒng)依賴的T3SS1和T6SS2調(diào)控機制研究.pdf

1、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）是一種海洋微生物，主要生存于海水，港口水環(huán)境及附著在海產(chǎn)品上，人們主要通過食用未煮熟的污染的海產(chǎn)品而感染，目前副溶血性弧菌已經(jīng)成為引起食物中毒的首要病原菌。密度感應系統(tǒng)(quorum-sensing，QS)是細菌中廣泛存在的細菌之間的信號傳遞機制，主要通過合成，釋放及感應自身誘導因子(autoinducers，AI)來感受生存環(huán)境的變化，繼而調(diào)控與細菌菌密度相關(guān)的系列基

2、因的轉(zhuǎn)錄表達。副溶血性弧菌QS系統(tǒng)影響細菌很多生物學功能，如生物膜的形成，菌落透明度的變化，細菌的運動能力等。AphA和OpaR是副溶血性弧菌QS系統(tǒng)的2個主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控子，分別在低菌密度(low cell density，LCD)和高菌密度（high celldensity，HCD）時高表達，并介導細菌在LCD和HCD之間進行轉(zhuǎn)換。
　　三型分泌系統(tǒng)(Type3 Secretion Systems，T3SS)是細菌蛋白分泌裝置，通

3、過把毒力效應蛋白注射入宿主細胞內(nèi)引起細胞損傷。副溶血性弧菌T3SS1以誘導宿主細胞程序性死亡或自噬的方式介導細菌的細胞毒性。副溶血性弧菌六型分泌系統(tǒng)Ⅱ(Type6 Secretion Systems2，T6SS2)主要介導其對宿主細胞的粘附作用，粘附是細菌與宿主細胞相互作用的首要步驟，是引起致病的必要條件。副溶血性弧菌T3SS1和T6SS2是其關(guān)鍵的的毒力因子，參與其致病的多種生物學功能。本課題著重研究QS中心調(diào)控子AphA和OpaR對

4、T3SS1和T6SS2的具體轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。
　　副溶血性弧菌T3SS1主要受exsACDE操縱子的調(diào)控。在副溶血性弧菌近緣菌哈氏弧菌中，QS系統(tǒng)中心調(diào)控子LuxR通過抑制exsA基因的表達來間接抑制T3SS1的表達。但是在副溶血性弧菌中QS系統(tǒng)調(diào)控T3SS1的詳盡機制并未報道。根據(jù)生物信息學預測，副溶血性弧菌中QS系統(tǒng)可能也是通過作用于exsACDE操縱子來調(diào)控T3SS1的轉(zhuǎn)錄;且根據(jù)操縱子結(jié)構(gòu)實驗我們確定了4個相應的靶基因進行研

5、究，exsC、exsB、exsD和VP1687（T3SS1效應蛋白基因）。
　　副溶血性弧菌T6SS2受OpaR蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，OpaR蛋白促進其表達，但是詳細的調(diào)控機制并未報道。根據(jù)生物信息學及相關(guān)文獻報道推測:QS系統(tǒng)可能通過直接作用于T6SS2的基因簇來調(diào)控其轉(zhuǎn)錄與表達。T6SS2基因簇由3個操縱子組成，我們選擇了每個操縱子的首位基因作為靶基因來進行研究，即T6SS2的靶基因為VPA1027、VPA1043和VPA1044。

6、
　　本研究利用自殺質(zhì)粒pDS132對aphA和opaR基因進行了缺失，并以pBAD33質(zhì)粒為載體進行了相應基因的回補，利用pET蛋白表達系統(tǒng)在大腸桿菌BL21(λDE3)中獲得了His-AphA和His-OpaR的重組蛋白，隨后用凝膠阻滯實驗(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)和DNA酶Ⅰ足跡實驗（DNaseI footpriting assay）研究調(diào)控子與靶基因啟動子區(qū)之間的

7、關(guān)系，并用引物延伸實驗和LacZ報告基因融合實驗研究調(diào)控子對靶基因的調(diào)控關(guān)系，繼而詳細闡述調(diào)控機制。
　　實驗結(jié)果表明:AphA通過激活exsC、exsB和exsD基因的轉(zhuǎn)錄來促進T3SS1(VP1687)的轉(zhuǎn)錄，繼而促進細菌對宿主細胞的細胞毒性;OpaR通過抑制exsC、exsB和exsD基因的轉(zhuǎn)錄來抑制T3SS1(VP1687)的轉(zhuǎn)錄，繼而抑制細菌對宿主細胞的細胞毒性。AphA和OpaR結(jié)合在 exsB基因的啟動子區(qū)序列上，直

8、接調(diào)控其的轉(zhuǎn)錄表達。AphA和OpaR對exsC和exsD的作用均是間接的。這個結(jié)果表明在菌密度較低時aphA大量表達從而促進T3SS1表達，致使微量的細菌就可以引起感染;在菌密度較高時opaR抑制T3SS1的表達，使細菌對宿主的致病力下降，進而促進其排出宿主體外，利于細菌的傳播。
　　AphA間接負向調(diào)控VPA1027、VPA1043和VPA1044的轉(zhuǎn)錄從而抑制T6SS2的轉(zhuǎn)錄;OpaR結(jié)合于這3個靶基因的啟動子區(qū)直接正向調(diào)控