AphA和OpaR對副溶血弧菌密度感應系統(tǒng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制研究.pdf

1、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一種嗜鹽性革蘭氏陰性弧菌，廣泛存在于淺海海水、海底沉積物及魚、蝦、蛤、貝、蟹等海產(chǎn)品中。當人們食用生的或未經(jīng)徹底煮熟的，且被攜帶關(guān)鍵毒力因子的副溶血弧菌污染的海產(chǎn)品時，就有可能感染，引起以發(fā)熱、惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等為主要癥狀的急性胃腸炎，嚴重者可發(fā)展成敗血癥，如若治療不及時可引起死亡。副溶血弧菌含有多種毒力因子，如直接耐熱溶血素（Thermostable direct h

2、emolysin，TDH）、耐熱相關(guān)溶血素(TDH-related hemolysin，TRH)、Ⅲ型分泌系統(tǒng)(TypeⅢ secretionsystem，T3SS)及莢膜多糖等，它們均與其致病性密切相關(guān)，其中TDH是神奈川現(xiàn)象的直接原因。目前，副溶血弧菌已是引起食物中毒的首要病原菌。
　　密度感應(quorum sensing，QS)是細菌中普遍存在一種級聯(lián)信號傳導機制，細菌通過合成、分泌并感應信號分子(自誘導因子，autoin

3、ducer)，最終通過激活或抑制其核心調(diào)控子的表達來控制細菌生物膜形成、毒力因子表達、耐藥性等細胞途徑，從而有利于細菌生存繁殖與致病。QS系統(tǒng)也普遍存在于弧菌中，其中以哈氏弧菌被研究的最為詳細:當處于低密度生長（Low cell density, LCD）時，細胞外低濃度的自誘導因子信號能使LuxO磷酸化，磷酸化后的LuxO能激活小RNA Qrr1-5的轉(zhuǎn)錄，Qrr1-5在Hfq伴侶蛋白的參與下激活AphA而抑制LuxR的表達，AphA

4、進而再調(diào)節(jié)下游毒力因子的表達和生物膜形成;當細菌處于高密度生長（High cell density, HCD）時，細胞外高濃度的自誘導因子信號能使磷酸化的LuxO去磷酸化，導致Qrr1-5不表達，使得Qrr1-5對AphA的激活及對LuxR的抑制作用被解除，此時LuxR大量表達后能調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄?？梢姡珹phA和LuxR分別是哈氏弧菌QS系統(tǒng)LCD和HCD下的核心調(diào)控子，QS系統(tǒng)正是通過控制其核心調(diào)控子的轉(zhuǎn)錄表達水平而實現(xiàn)對生物膜形

5、成和毒力基因的表達調(diào)控。
　　哈氏弧菌QS系統(tǒng)的信號合成與傳導機制所需的所有基因，在副溶血弧菌中均能找到同源的基因，如副溶血弧菌在LCD時的核心調(diào)控子是AphA，而在HCD時的核心調(diào)控子是OpaR，二者與哈氏弧菌的AphA和LuxR均具有90％以上的同源性。但是，目前對副溶血弧菌QS系統(tǒng)的級聯(lián)信號傳導機制，及AphA和OpaR功能的認識還很膚淺，亟需深入系統(tǒng)地研究。本文中，我們分別通過比較弧菌中OpaR和AphA及其直系同源蛋白已

6、知和可能的結(jié)合序列，并利用在線工具Regulatory Sequence Analysis Tools(RSAT，http://rsat.ulb.ac.be/rsat/)計算結(jié)合序列中每個位置上4種堿基出現(xiàn)的概率（Position frequency matrix，PFM），以構(gòu)建OpaR和AphA的識別基序，結(jié)果顯示OpaR和AphA的結(jié)合基序分別為TATTGATAAA-TTTATCAATA和ATATGCA-N6-TGCATAT，二者

7、均為一個反向互補重復序列。分別利用上述基序預測副溶血弧菌QS系統(tǒng)級聯(lián)信號傳導過程中哪些關(guān)鍵基因是受OpaR和AphA直接調(diào)控的，結(jié)果顯示:OpaR對自身基因、aphA和qrr2-4，AphA對自身基因、opaR和qrr4可能具有直接的調(diào)控作用。進而，我們利用凝膠阻滯實驗(EMSA)、DNaseⅠ足跡實驗、β-半乳糖苷酶報告基因融合實驗(LacZ)、引物延伸及qRT-PCR等實驗技術(shù)分別研究OpaR和AphA對上述靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，結(jié)

8、果表明:當用HI-0.5％S平板培養(yǎng)副溶血弧菌至高密度時，OpaR能直接抑制qrr2-4、aphA和opaR的轉(zhuǎn)錄表達，其結(jié)合位點均包含一段與基序相似的序列;當用M肉湯培養(yǎng)副溶血弧菌至低密度(OD600=0.15-0.2)時，AphA能直接抑制qrr4、aphA和opaR的轉(zhuǎn)錄，其結(jié)合位點也均包含一段與基序相似的序列;另外，AphA對qrr2-3的轉(zhuǎn)錄具有間接抑制作用。由于OpaR和AphA對上述基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制與哈氏弧菌中的完全一致

9、，因此上述結(jié)果不僅表明我們所構(gòu)建基序的可靠性與實用性，也說明了副溶血弧菌QS系統(tǒng)級聯(lián)信號傳導機制與哈氏弧菌的基本一致，這為后續(xù)實驗打下了堅實的基礎(chǔ)。
　　副溶血弧菌在自然生存與感染致病的過程中，必然面臨眾多環(huán)境信號的刺激，比如溫度、pH、滲透壓等，在此過程中其毒力因子的表達必然是被復雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡緊密調(diào)控的，而解析這個調(diào)控網(wǎng)絡有助于理解副溶血弧菌的致病機制。ToxR是副溶血弧菌的毒力調(diào)控因子，已有研究表明它能調(diào)控溶血素基因tdh

10、、T3SS1相關(guān)基因及外膜蛋白基因ompU的表達，但是其調(diào)控的分子機制仍然未被闡明。VPA0606是AraC家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控子，目前只知道該蛋白能影響副溶血弧菌生物膜形成，但對其分子作用機制一無所知。另外，VPA0606可能還參與調(diào)控副溶血弧菌毒力因子的表達。在副溶血弧菌基因組中，vpa0607與vpa0606轉(zhuǎn)錄方向相同，且二者基因間區(qū)僅有71 bp，RT-PCR結(jié)果表明二者共轉(zhuǎn)錄，vpa0607為首基因。引物延伸結(jié)果顯示toxR和vp

11、a0607表達也呈現(xiàn)出密度感應的特性，這提示OpaR和AphA可能對toxR和vpa0607的轉(zhuǎn)錄具有調(diào)控作用。因此，我們采用HI-0.5％S肉湯培養(yǎng)副溶血弧菌研究了OpaR和AphA對toxR和vpa0607的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。
　　我們首先采用引物延伸和Western blot研究了菌密度對opaR、vpa0606、aphA和toxR的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，結(jié)果表明:opaR和vpa0606在OD600=0.6-0.8時表達水平高，aphA在

12、OD600=0.05-0.2時轉(zhuǎn)錄水平高，toxR在OD600=0.2-0.4時轉(zhuǎn)錄水平高。進而，我們采用引物延伸、LacZ等實驗技術(shù)研究了OpaR和AphA對自身基因及對toxR和vpa0607的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，結(jié)果表明:在OD600=0.05-0.2時，AphA直接抑制aphA和opaR，而間接抑制toxR的轉(zhuǎn)錄，但是AphA對vpa0607-0606具有間接的激活作用;在OD600=0.6-0.8時，OpaR能直接抑制aphA、op

13、aR和vpa0607-0606，而間接抑制toxR的轉(zhuǎn)錄。由于OD600=0.05-0.2時AphA激活vpa0607-0606的轉(zhuǎn)錄，這提示vpa0607-0606可能在低密度下轉(zhuǎn)錄水平高，引物延伸結(jié)果顯示該操縱子的轉(zhuǎn)錄特性確實與aphA的一致。然而，vpa0606與vpa0607共轉(zhuǎn)錄，VPA0606又在OD600=0.6-0.8時蛋白表達水平高，這似乎相互矛盾。實際上，VPA0607蛋白是一種DNaseⅡ，能從mRNA的3'-端向

14、5'-端水解磷酸二酯鍵，從而使RNA降解。我們推測:只有當細胞內(nèi)VPA0607蛋白水平低時，處于基礎(chǔ)表達的vpa0607-0606才能得以翻譯成VPA0606蛋白。這種假設(shè)需要我們后續(xù)進行實驗驗證。
　　總之，我們的實驗結(jié)果不僅證明了副溶血弧菌QS系統(tǒng)和哈氏弧菌具有相似的級聯(lián)信號傳導機制，而且顯示出ToxR和VPA0606也參與到QS系統(tǒng)的調(diào)控機制中來。AphA、OpaR、ToxR和VPA0606隨菌密度的變化而表現(xiàn)出不同的表達豐