致病性副溶血性弧菌的恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法的研究.pdf

1、副溶血性弧菌是一種革蘭氏陰性嗜鹽細(xì)菌，食用感染了攜帶致病因子的副溶血性弧菌的海鮮會(huì)造成食物中毒，主要表現(xiàn)在腹瀉，痙攣，惡心，嘔吐等癥狀。隨著全球感染副溶血性弧菌的案例增多，韓國(guó)，日本，和歐盟等國(guó)家已經(jīng)把副溶血性弧菌的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工作提上日程。因此，能否快速檢測(cè)出食品中的致病性副溶血性弧菌已成為公眾健康的重要問(wèn)題。然而在自然環(huán)境和食品中，并非所有的副溶血性弧菌都攜帶致病因子，其中耐熱溶血毒素（TDH）和耐熱相關(guān)溶血毒素（TRH）已被確認(rèn)為兩種

2、重要的毒力因子。
　　為了提供方便簡(jiǎn)捷、靈敏度高、特異性強(qiáng)致病性副溶血性弧菌的檢測(cè)方法。本文分別以對(duì)副溶血性弧菌耐熱溶血毒素，耐熱相關(guān)溶血毒素為模板建立了兩種常見水產(chǎn)品病原菌的LAMP檢測(cè)方法，對(duì)反應(yīng)體系及反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化篩選，確定了其特異性及靈敏度，同時(shí)發(fā)展出對(duì)tdh和trh基因同時(shí)檢測(cè)技術(shù)以及結(jié)合免疫磁珠建立了IMS-dLAMP方法，并將所建立的檢測(cè)方法應(yīng)用到了實(shí)際樣品中，結(jié)果如下：
　　1.基于tdh基因的副溶血性弧

3、菌LAMP檢測(cè)方法的建立
　　以tdh毒力基因?yàn)榘谢?，分別設(shè)計(jì)一組引物，進(jìn)行引物的驗(yàn)證，環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系的優(yōu)化，特異性分析以及靈敏度實(shí)驗(yàn)。tdh基因LAMP的最佳反應(yīng)條件為：鎂離子終濃度為6mM，dNTPs濃度為1.0mM，反應(yīng)體系在63℃下45min即能有理想擴(kuò)增效果。加入SYBR Green I后，能用肉眼進(jìn)行結(jié)果的判斷。常見細(xì)菌作對(duì)照，顯示反應(yīng)引物具有很強(qiáng)的特異性。tdh基因的LAMP反應(yīng)體系對(duì)于純培養(yǎng)物的靈敏度檢測(cè)

4、中，反應(yīng)的靈敏度達(dá)到8.20×102 CFU/mL。人工污染蝦樣的靈敏度檢測(cè)限為9.40×102 CFU/25g。而PCR的檢測(cè)限為104 CFU/mL。即LAMP的檢測(cè)限比PCR低100倍。
　　2.基于trh基因的副溶血性弧菌LAMP檢測(cè)方法的建立
　　trh基因 LAMP的最佳反應(yīng)條件為：鎂離子終濃度為8mM，dNTPs濃度為1.0mM，反應(yīng)體系在63℃下45min即能有理想擴(kuò)增效果。產(chǎn)物經(jīng)過(guò)熒光染色后發(fā)生顏色變化，產(chǎn)

5、物檢測(cè)方便。trh基因的LAMP反應(yīng)體系純培養(yǎng)物的靈敏度檢測(cè)中，反應(yīng)的靈敏度達(dá)到2.64×104 CFU/mL。人工污染蝦樣的靈敏度檢測(cè)限為9.14×103 CFU/25g。PCR檢測(cè)限為106 CFU/mL，檢測(cè)限高于LAMP檢測(cè)100倍。
　　3.基于tdh和trh基因的副溶血性弧菌多重LAMP檢測(cè)方法的建立
　　tdh和trh多重環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的最佳反應(yīng)條件為：鎂離子終濃度為8mM，dNTPs濃度為1.0mM，反應(yīng)

6、體系在63℃下45min即能有理想擴(kuò)增效果。以8株致病性弧菌，5株非致病性副溶血性弧菌及8株非副溶血性弧菌DNA作為模板進(jìn)行特異性測(cè)試，同時(shí)，采集了11個(gè)月3個(gè)水產(chǎn)品市場(chǎng)的2種蝦，將dLAMP與PCR結(jié)果進(jìn)行比較，沒有發(fā)生交叉反應(yīng)說(shuō)明引物具有高度的特異性。在靈敏度實(shí)驗(yàn)中，純培養(yǎng)物的靈敏度達(dá)到了6.42×101 CFU/mL（DNA濃度為1.65 fg/μL），人工污染樣品的靈敏度達(dá)到了8.0×101 CFU/25g（DNA濃度為0.83

7、2 pg/μL）。與PCR比較，高2-3個(gè)數(shù)量級(jí)，與熒光定量PCR不相上下。但所需儀器簡(jiǎn)便，可在基礎(chǔ)研究室操作。
　　4.免疫磁珠IMS與dLAMP結(jié)合檢測(cè)副溶血性弧菌
　　免疫磁珠吸附能夠有效的加快預(yù)增菌的時(shí)長(zhǎng)。但是其特異性的缺陷需要結(jié)合生物學(xué)方法彌補(bǔ)。本研究對(duì)低濃度的人工污染樣品進(jìn)行培養(yǎng)，免疫磁珠富集，dLAMP技術(shù)檢測(cè)致病性副溶血性弧菌，從結(jié)果可以看出當(dāng)濃度低至0.08 logCFU/25g時(shí)，通過(guò)培養(yǎng)3.5h后，能夠