Myh14在聽覺系統(tǒng)中的功能研究.pdf

1、Myh14編碼非肌肉肌球蛋白Ⅱ重鏈14(NMHCⅡ C)，是肌球蛋白家族的一員，參與許多細胞運動過程，如離子通道門控、細胞器易位以及細胞骨架重排。Myh14突變會導(dǎo)致DNFA4型耳聾。有研究表明，Myh14是一個噪聲性耳聾易感基因的候選基因。然而，Myh14在聽覺系統(tǒng)和噪聲性耳聾中的作用目前尚不清楚。本課題的研究目的在于研究Myh14在聽覺系統(tǒng)中的作用以及驗證其是否與噪聲性耳聾有關(guān)，以希望闡明其生物學(xué)功能以及引起噪聲性耳聾分子機制，對D

2、NFA4型耳聾的發(fā)病機制以及噪聲性耳聾的預(yù)防與治療提供科學(xué)依據(jù)。
　　本研究利用CRISPR-Cas9技術(shù)，在CBA/CaJ品系的小鼠中成功制作了Myh14基因敲除小鼠模型。通過對Myh14基因敲除小鼠模型的表型分析和功能研究，我們對Myh14在聽覺系統(tǒng)中的作用進行了探討。本研究通過基底膜鋪片免疫熒光染色，檢測MYH14在耳蝸上皮細胞中的定位，結(jié)果表明MYH14定位于毛細胞與相鄰細胞之間的頂端連接復(fù)合物處。本研究通過耳蝸石蠟切片H

3、&E染色觀察3月齡小鼠耳蝸的形態(tài)變化，結(jié)果顯示Myh14基因敲除型小鼠耳蝸形態(tài)沒有異常。利用ABR檢測小鼠聽力變化，Myh14基因敲除小鼠在5月齡時開始出現(xiàn)聽力損失。通過基底膜鋪片免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)5月齡的Myh14基因敲除小鼠出現(xiàn)底回外毛細胞丟失，通過對外毛細胞丟失百分比統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)耳蝸底回的外毛細胞丟失具有統(tǒng)計學(xué)意義。通過免疫印跡法檢測耳蝸中MYH9和MYH10蛋白的表達水平，得知在Myh14基因敲除型小鼠中MYH10的表達量明顯升高，

4、MYH9的表達量沒有變化。通過建立噪聲后暫時性聽力閾移小鼠模型，WesternBlot檢測噪聲前后不同時間段的小鼠耳蝸MYH14蛋白的表達，我們發(fā)現(xiàn)MYH14在耳蝸中的表達是噪聲依賴性的。通過對噪聲小鼠模型在噪聲前后不同時間段ABR測聽，與野生型相比，Myh14敲除型小鼠無論是混音還是短純音都不能完全恢復(fù)，表明突變型小鼠的聽力更容易受到高強度噪聲的影響。通過對噪聲后2周的噪聲小鼠模型耳蝸基底膜整封染色，觀察到在噪聲刺激后2周的Myh14

5、敲除型小鼠比野生型小鼠出現(xiàn)明顯更多的毛細胞丟失，通過對外毛細胞丟失百分比統(tǒng)計，表明Myh14基因敲除型小鼠的外毛細胞丟失具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　本研究建立的Myh14基因敲除型小鼠為研究Myh14基因在聽覺系統(tǒng)的功能提供了良好的動物模型。本研究的結(jié)果表明，Myh14基因敲除型小鼠直到5月齡才出現(xiàn)輕微的高頻聽力閾移，這很可能是在Myh14基因敲除型小鼠中其同一家族的Myh10互補了它的部分功能。Myh14的表達是噪聲依賴性的，CBA/