大鼠心肌缺血再灌注早期心肌組織與血清中TNF-α、IL-6、IL-10的變化及3-AB對心肌梗死面積的影響.pdf

1、隨著人們生活水平的提高，冠心病已成為威脅人類生命和健康的最主要?dú)⑹种?，其中急性心肌梗死是心衰和死亡的主要原因，盡早給予急性心肌梗死患者再灌注治療是挽救瀕死心肌、恢復(fù)心臟功能積極有效的方法。但是再灌注治療過程同時存在再灌注損傷，后者減弱了再灌注給機(jī)體帶來的益處，因此，如何才能減輕再灌注損傷自然成了研究的重點(diǎn)內(nèi)容。近年來大量的研究表明，過度的炎癥反應(yīng)是心肌缺血再灌注損傷的主要機(jī)制之一，腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素6(IL-6)

2、等促炎細(xì)胞因子明顯表達(dá)并占主導(dǎo)地位。隨著PCI技術(shù)的普及和發(fā)展，越來越多的心肌梗死病人能夠接受直接PCI，梗死心肌得到及時的再灌注，但在這一治療過程中，常常強(qiáng)調(diào)抗血小板、抗凝藥物的應(yīng)用的必要性，卻往往忽略抑制炎性細(xì)胞因子及其他減輕再灌注損傷藥物的應(yīng)用。有研究表明，1型多聚ADP-核糖聚合酶(PARP-1)活化對細(xì)胞因子的產(chǎn)生途徑起重要的調(diào)節(jié)作用。本研究應(yīng)用大鼠心肌缺血再灌注模型，觀察心肌缺血再灌注早期心肌組織及血清中細(xì)胞因子IL-6、T

3、NF-a及IL-10的動態(tài)變化及相關(guān)性，同時應(yīng)用PARP-1抑制劑3-氨基苯甲酰胺(3-AB)，觀察其對IL-6、TNF-a、IL-10表達(dá)及心肌梗死面積的影響，探討其作用機(jī)制。
　　 材料與方法
　　 一、實(shí)驗(yàn)材料
　　 1、實(shí)驗(yàn)動物
　　 雄性Wistar大鼠260-300 g，由中國醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。分籠飼養(yǎng)于恒溫(20(±)2℃)、恒濕(50-60％)、無特殊病原體條件下，飲用水和標(biāo)準(zhǔn)飼料

4、均經(jīng)滅菌后供動物自由取用。
　　 2、主要試劑
　　 ELASA試劑盒（美國R&D公司）;3-氨基苯甲酰胺（美國Sigma公司）;氯化三苯四氮唑（美國Sigma公司）;伊文氏蘭（瑞士Fluka公司）
　　 3、實(shí)驗(yàn)儀器
　　 心電圖機(jī)（上海光電儀器有限公司），動物人工呼吸機(jī)（上海嘉鵬科技有限公），高速冰凍離心機(jī)(Sigma，Germany)，光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS，Japan)，石蠟切片機(jī)RM-214

5、5（德國Leica公司），低溫冰箱（SANYO，Japan），ELX-800型酶標(biāo)儀(Bio-tek，USA)。
　　 二、實(shí)驗(yàn)方法
　　 （一）動物分組及模型制作
　　 1、動物分組
　　 將134只大鼠隨機(jī)分為:
　　 (1)缺血再灌注組:
　　 缺血再灌注15min組（I/R15min組，n=8）;
　　 缺血再灌注30min組（I/R30min組，n=8）;
　　

6、缺血再灌注1h組（I/R1h組，n=8）;
　　 缺血再灌注2h組（I/R2h組，n=8）;
　　 缺血再灌注4h組（I/R4h組，n=8）;
　　 缺血再灌注6h組（I/R6h組，n=8）;
　　 缺血再灌注24h組（I/R24h組，n=8）;
　　 (2)假手術(shù)組:
　　 假手術(shù)15min組（sham15min組，n=6）;
　　 假手術(shù)30min組（sham30min組，n=

7、6）;
　　 假手術(shù)1h組（sham1h組，n=6）;
　　 假手術(shù)2h組（sham2h組，n=6）;
　　 假手術(shù)4h組（sham4h組，n=6）;
　　 假手術(shù)6h組（sham6h組，n=6）;
　　 假手術(shù)24h組（sham24h組，n=6）;
　　 (3)缺血再灌注2h+3AB組（I/R2h+3AB組，n=12）:①檢測心肌梗死面積，n=6;②檢測心肌組織及血清中各指標(biāo)，n=6;<

8、br>　　 (4)缺血再灌注2h+生理鹽水組（I/R2h+生理鹽水組，n=12）:①檢測心肌梗死面積，n=6;②檢測心肌組織及血清中各指標(biāo)，n=6;
　　 (5)假手術(shù)+3AB組（sham+3AB組，n=6）;
　　 (6)假手術(shù)+生理鹽水組（sham+生理鹽水組，n=6）;
　　 2、大鼠心肌缺血再灌注損傷模型制備
　　 大鼠用10％水合氯醛0.4mL/100g腹腔注射麻醉，取仰臥位固定，氣管切開插管

9、行小動物呼吸機(jī)輔助呼吸，潮氣量10 mL/kg，吸呼比1∶1.5，呼吸頻率75次/min。在第四肋間行左胸廓切開術(shù)，打開心包，擠出大部分心臟。暴露左心耳，以5/0線在距冠狀動脈前降支根部1-2mm形成一個直徑約5mm的活結(jié)，將長度約5mm的PE-10聚乙烯軟管置于活結(jié)中，結(jié)扎后，見左室游離壁立即變白（或發(fā)紺）及心電圖ST段抬高或QRS波寬高畸形并持續(xù)存在為結(jié)扎成功。45min后拔出聚乙烯軟管，使冠狀動脈血流再通，再灌注時局部組織充血及心

10、電圖ST段回落或QRS變窄。假手術(shù)組在相同部位穿線但不結(jié)扎。缺血再灌注2h+3AB組:建立(I/R)模型，分別于再灌注前15min及其后1小時給予3-AB(20mg/kg，iv)。缺血再灌注2h+生理鹽水組:建立(I/R)模型，分別于再灌注前15min及其后1h給予等體積生理鹽水靜注。假手術(shù)+3AB組:建立假手術(shù)模型，分別于與手術(shù)藥物干預(yù)組相同時間點(diǎn)（開胸后30分鐘其后1小時）給予3-AB(20mg/kg，iv)。假手術(shù)+生理鹽水組:建

11、立假手術(shù)模型，分別于與手術(shù)藥物干預(yù)組相同時間點(diǎn)（開胸后30分鐘其后1小時）給予等體積生理鹽水靜注。
　　 （二）檢測方法
　　 1、多媒體彩色病理圖像分析系統(tǒng)測量心肌梗死范圍（infarction size）。
　　 2、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清細(xì)胞因子IL-6、IL-10、TNF-a的表達(dá)。
　　 3、心肌組織勻漿細(xì)胞因子IL-6、IL-10、TNF-a檢測用ELISA法，操作過程同血清內(nèi)細(xì)

12、胞因子檢測，同時用考馬斯亮藍(lán)蛋白測定法檢測每個組織標(biāo)本的蛋白含量，得出數(shù)值后，將每毫升勻漿液中的細(xì)胞因子含量換算成每毫克蛋白中的細(xì)胞因子含量。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 1、 I/R各組(I/R15min、I/R30 min、I/R1h、I/R2h、I/R4hI/R、I/R6h、I/R24h)心肌組織中TNF-a含量(pg/mg)、IL-6的含量(pg/mg)、IL-10含量(pg/mg)和血清中TNF-a含量(ng/ml)

13、、IL-6的含量(pg/ml)、IL-10含量(pg/ml)均明顯表達(dá)，與對應(yīng)時間點(diǎn)的sham組(sham15min、sham30 min、sham1h、sham2h、sham4h、sham6h、sham24h)比較有顯著差異(P＜0.05)。
　　 2、I/R2h+3AB組心肌中TNF-a含量(pg/mg)、IL-6含量(pg/mg)、IL-10含量（pg/mg）和血清中TNF-a含量(ng/ml)、IL-6的含量(pg/ml

14、)、IL-10含量（pg/ml）與I/R2h+生理鹽水組比較有顯著差異(P＜0.01)，與sham+3AB組比較有顯著差異(P＜0.01)。
　　 3、缺血再灌注早期心肌組織中細(xì)胞因子IL-6、IL-10、TNF-a的含量與血清中IL-6、IL-10、TNF-a的含量具有正相關(guān)性(P＜0.01)。
　　 4、I/R2h+3AB組心肌梗死面積(infarct size，IS)（20.02±2.23）％與I/R2h+生理鹽水

15、組（33.24±3.79）％比較有顯著差異(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、心肌缺血再灌注早期心肌組織及血清中細(xì)胞因子白介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF-a)、白介素10(IL-10)均明顯表達(dá)，再灌注15分鐘至2小時各指標(biāo)均逐漸升高，4小時至6小時逐漸下降，24小時又略有升高，呈峰值為再灌注2-4小時的動態(tài)變化。
　　 2、缺血再灌注早期心肌組織中細(xì)胞因子IL-6、IL-10、TNF-a的含量

16、與血清中IL-6、IL-10、TNF-a的含量具有正相關(guān)性。
　　 3、3-AB對心肌缺血再灌注早期的保護(hù)作用的途徑之一是通過抑制白介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF-a)等促炎細(xì)胞因子的表達(dá)實(shí)現(xiàn)，而不是通過升高保護(hù)性細(xì)胞因子IL-10實(shí)現(xiàn)。
　　 4、3-AB對細(xì)胞因子IL-6、TNF-a有明顯抑制作用，能減輕心肌再灌注心肌損傷，減小心肌梗死面積。心肌缺血再灌注早期，積極有效的應(yīng)用IL-6、TNF-a等細(xì)胞因子抑