大鼠牙源性細(xì)胞復(fù)合Nhac-PLA形成牙體組織-骨復(fù)合體樣結(jié)構(gòu)及ADAM28基因作用的研究.pdf

1、種子細(xì)胞、生物支架、生長(zhǎng)因子和微環(huán)境并稱為組織工程的四要素。組織工程牙是將從成牙組織中分離的生物活性細(xì)胞“種植”到載體支架上,并提供細(xì)胞增殖和分化的生長(zhǎng)因子微環(huán)境,在體外或體內(nèi)植入形成有活性的牙齒樣結(jié)構(gòu)和牙齒。制備適宜的支架材料,尋找種子細(xì)胞培養(yǎng)的最優(yōu)條件,探索最佳的生長(zhǎng)因子或生長(zhǎng)因子組合,是組織工程牙研究的方向。生長(zhǎng)因子的開(kāi)發(fā)和合理運(yùn)用是促進(jìn)種子細(xì)胞再生潛力發(fā)揮的重要因素之一,現(xiàn)今國(guó)內(nèi)外有關(guān)生長(zhǎng)因子單獨(dú)作用于細(xì)胞.支架復(fù)合體的研究比較

2、普遍,但兩種或多種因子復(fù)合應(yīng)用的效果尚未見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道.納米羥基磷灰石-膠原/聚乳酸(nanometer hydroxyapatite-collagen/polylactic acid,nHAC/PLA)生物支架是仿生納米級(jí)植骨材料,具有良好的組織相容性、優(yōu)異的生物活性、高效的骨誘導(dǎo)性及可降解性.本研究首次將不同組合生長(zhǎng)因子bFGF+IGF1、TGF-β1+BMP4、bFGF+IGF1+TGF-β1+BMP4分別誘導(dǎo)大鼠牙源性上皮細(xì)胞(rD

3、ECs)、間充質(zhì)細(xì)胞(rDMCs)后分層接種于nHAC/PLA三維支架上,移植入免疫缺陷小鼠體內(nèi),以誘導(dǎo)形成牙體組織-骨復(fù)合體樣結(jié)構(gòu),并對(duì)其進(jìn)行鑒定分析,期望為頜骨缺損及牙齒缺失的再生修復(fù)提供可行性依據(jù)。
　　 牙齒發(fā)育是兩種相鄰組織-外胚上皮和神經(jīng)嵴來(lái)源的間充質(zhì)相互作用的結(jié)果,呈時(shí)空變化的基因調(diào)控在牙胚發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和凋亡,決定牙胚的發(fā)育進(jìn)程。金屬蛋白酶解離素28(a disintegrin an

4、dmetalloprotonase28,ADAM28)是定位于細(xì)胞表面、擁有蛋白水解和黏附特性且具備自身催化活性的的跨膜分泌型糖蛋白,是從先天性牙根發(fā)育不良(congenitalhypoplasia of tooth root,CHTR)患者的差異表達(dá)基因中篩選出來(lái)的可能致病基因之一,有關(guān)其在牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)分布及作用機(jī)理尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究應(yīng)用免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù),對(duì)ADAM28在人牙周膜干細(xì)胞(human pe

5、riodontal ligament stem cells,HPDLSCs)、人牙髓干細(xì)胞(human dentalpulp stem cells,HDPSCs)中的分布特征及對(duì)兩類細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及可能的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了初步探討。全文共分三部分,主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　 第一部分大鼠牙源性細(xì)胞復(fù)合nHAC/PLA支架體內(nèi)形成牙體組織-骨復(fù)合體樣結(jié)構(gòu)的研究
　　 目的:探討經(jīng)不同組合生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的大鼠牙源性上皮細(xì)

6、胞、間充質(zhì)細(xì)胞復(fù)合nHAC/PLA支架體內(nèi)形成牙體組織-骨復(fù)合體樣結(jié)構(gòu)的能力。
　　 方法:
　　 1.應(yīng)用酶消化法和差速消化法分離培養(yǎng)大鼠牙源性上皮細(xì)胞((rat dental epithelialcells,rDECs)和牙源性間充質(zhì)細(xì)胞(rat dental mesenchymal cells,rDMCs),經(jīng)cytokeratin、vimentin免疫熒光染色鑒定其來(lái)源。
　　 2.應(yīng)用組織學(xué)染色(茜素紅

7、、ALP鈣-鈷法)檢測(cè)礦化液誘導(dǎo)下rDMCs的成骨特性。應(yīng)用免疫組化染色、Real-time PCR和western blot檢測(cè)rDMCs在不同組合因子bFGF+IGF1(組①)、TGF-β1+BMP4(組②)、bFGF+IGF1+TGF-β1+BMP4(組③)誘導(dǎo)下CAP、DSPP、OCN、OPN的表達(dá)差異。
　　 3.應(yīng)用四唑鹽比色法(MTT)檢測(cè)不同因子組合誘導(dǎo)后rDMCs的增殖活性,酶動(dòng)力學(xué)法檢測(cè)總蛋白和ALP值,羅式

8、診斷分析法和放射免疫分析法分別檢測(cè)rDMCs上清液內(nèi)鈣、磷和骨鈣素濃度。
　　 4.應(yīng)用掃描電鏡觀測(cè)rDECs、rDMCs分層復(fù)合nHAC/PLA支架后的生物相容性.
　　 5.將各組細(xì)胞-支架復(fù)合物移植裸鼠皮下3月、5月后分別取材,應(yīng)用H&E、甲苯胺藍(lán)、Goldner三色和免疫組化染色檢測(cè)移植物形成牙體組織.骨復(fù)合體樣結(jié)構(gòu)的能力。
　　 結(jié)果:
　　 1.成功分離培養(yǎng)、鑒定大鼠牙源性上皮細(xì)胞和問(wèn)充質(zhì)細(xì)胞

9、,經(jīng)礦化液誘導(dǎo)后的rDMCs鈣結(jié)節(jié)和ALP染色陽(yáng)性.組①、②中CAP、OCN、DSPP、OPN mRNA和蛋白的表達(dá)水平均顯著高于空白對(duì)照組④(未加因子的DF12培養(yǎng)液),其中組①CAP、OCN和組②DSPP、OPN的表達(dá)水平最高。
　　 2.組①的OD值在第4d、7d顯著高于其他3組,并在第4d達(dá)到峰值。組①、②、③在第7d的總蛋白和ALP值均顯著高于對(duì)照組④,以組②表達(dá)最高。4組的鈣、磷濃度均在第10d達(dá)最高值,在各時(shí)間點(diǎn),

10、組①的鈣、磷濃度顯著高于其他3組。組②的骨鈣素(OCN)在第4d達(dá)到峰值,同時(shí)4組均在第7d達(dá)最低值,其中組③在第7d的骨鈣素含量最低。
　　 3.掃描電鏡顯示:rDECs、rDMCs復(fù)合nHAC/PLA共培養(yǎng)5d后,橢圓形的rDECs和長(zhǎng)梭形的rDMCs胞體充分伸展,胞質(zhì)中膠原纖維和基質(zhì)分泌豐富,細(xì)胞與支架相互交織成網(wǎng)狀。10d后,rDECs、rDMCs胞質(zhì)中基質(zhì)分泌更加豐富,覆蓋部分細(xì)胞,并與支架相融合。
　　 4.

11、細(xì)胞-支架復(fù)合物移植后3月,組①、②、③在細(xì)胞.支架接觸部位均發(fā)現(xiàn)類骨質(zhì)、新生成熟骨和血管形成,并有OCN、OPN的陽(yáng)性表達(dá)。組②TGF-β1+BMP4的促成骨作用最強(qiáng),可見(jiàn)布滿骨髓基質(zhì)細(xì)胞的骨髓腔?？瞻讓?duì)照組④沒(méi)有新生骨形成,僅有少量膠原纖維和血管。移植后5月,組①、③均形成沒(méi)有髓腔的牙根樣結(jié)構(gòu),部分區(qū)域有DSPP、DMP1、CAP的表達(dá)。組②形成周邊有新生骨、中央有單根牙體樣組織,內(nèi)有髓腔樣結(jié)構(gòu)(含有牙髓樣組織和血管),并有DSPP

12、、DMP1、OPN、OCN在髓腔內(nèi)壁牙本質(zhì)基質(zhì)、部分牙髓樣組織和血管內(nèi)的陽(yáng)性表達(dá),ameloblastin、CAP分別在釉質(zhì)樣、牙骨質(zhì)樣組織中表達(dá)陽(yáng)性?？瞻讓?duì)照組④形成新生骨,并有OCN的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),但未見(jiàn)形成牙體樣結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)論:
　　 1.rDMCs經(jīng)礦化液誘導(dǎo)后具有成骨特性。組①bFGF+IGF1可顯著促進(jìn)rDMCs的增殖活性(第4d)和CAP、OCN的表達(dá),加速rDMCs向成牙骨質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞的分化和基質(zhì)礦

13、化(第4d),升高細(xì)胞外液的鈣、磷離子濃度(第10d).組②TGF-β1+BMP4能顯著提高OCN、DSPP、OPN的分泌水平(第4d),促進(jìn)rDMCs的總蛋白合成和ALP活性(第7d),提示TGF-β1+BMP4可加速rDMCs向成骨細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞分化與骨基質(zhì)、牙本質(zhì)基質(zhì)的礦化,顯示其成骨趨向.組③則顯著抑制OCN的分泌(第7d),降低rDMCs向成骨細(xì)胞的分化速度,提示4種因子之間并不具備顯著的協(xié)同作用。
　

14、　 2.rDECs+rDMCs復(fù)合nHAC/PLA支架后增殖、分化旺盛,生物相容性良好。
　　 3.經(jīng)TCF-β1+BMP4誘導(dǎo)的rDECs+rDMCs-nHAC/PLA體內(nèi)移植物的促成骨和成牙作用最強(qiáng),移植后5月形成了牙體組織-骨復(fù)合體樣結(jié)構(gòu)。
　　 第二部分 ADAM28基因?qū)θ搜乐苣じ杉?xì)胞增殖、分化和凋亡特性的影響
　　 目的:探討ADAM28對(duì)人牙周膜干細(xì)胞(HPDLSCs)增殖、分化、凋亡等生物學(xué)特性

15、的影響和可能的作用機(jī)制.
　　 方法:
　　 1.利用酶聯(lián)合消化法(typeⅠcollagenase+dispase)原代培養(yǎng)人牙周膜成纖維細(xì)胞,間接免疫磁珠法加以分離純化,經(jīng)免疫熒光染色鑒定HPDLSCs的來(lái)源。
　　 2.應(yīng)用基因重組技術(shù)構(gòu)建并鑒定ADAM28真核表達(dá)質(zhì)粒,經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染HPDLSCs48h后,應(yīng)用免疫熒光、RT-PCR和western blot檢測(cè)ADAM28在HPDLSCs中的表達(dá)水平。

16、
　　 3.將經(jīng)過(guò)全硫代修飾及FITC熒光標(biāo)記的ADAM28反義核酸(antisenseoligodeoxynucleotide,AS-ODN)及和正義對(duì)照S-ODN轉(zhuǎn)染HPDLSCs48h后,應(yīng)用免疫熒光、RT-PCR和western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率和封閉效率。
　　 4.將成功構(gòu)建的ADAM28真核表達(dá)質(zhì)粒、空載體pcDNA3.1(+)、AS-ODN、S-ODN同時(shí)轉(zhuǎn)染HPDLSCs,應(yīng)用四唑鹽比色法(MTT)

17、、流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM)、酶動(dòng)力學(xué)法、免疫細(xì)胞化學(xué)和western blot研究各組對(duì)HPDLSCs增殖、分化、凋亡的影響并分析可能的作用機(jī)制。
　　 結(jié)果:
　　 1.成功獲得STRO-1(+)的HPDLSCs,證明是來(lái)源于中胚層的間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　 2.成功克隆ADAM28基因的編碼區(qū)全長(zhǎng)2327bp,構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-ADAM28；并經(jīng)酶切鑒定、PCR鑒定

18、和核苷酸序列分析正確無(wú)誤。將ADAM28真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HPDLSCs48h后,細(xì)胞胞質(zhì)強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)ADAM28蛋白,可與抗ADAM28蛋白的抗體發(fā)生特異性結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平證明ADAM28在HPDLSCs內(nèi)能被正確地翻譯、表達(dá)。
　　 3.ADAM28 AS-ODN的轉(zhuǎn)染效率和封閉效率較高,可有效抑制HPDLSCs內(nèi)ADAM28 mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　 4.ADAM28真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后可顯著促進(jìn)HPDLSCs的增殖并

19、抑制其分化,ADAM28AS-ODN則顯著抑制HPDLSCs的增殖并促進(jìn)其分化,下調(diào)HPDLSCs內(nèi)CAP的表達(dá)水平并誘導(dǎo)HPDLSCs的凋亡.
　　 結(jié)論:ADAM28真核表達(dá)質(zhì)粒通過(guò)激活A(yù)DAM28基因的類金屬蛋白酶功能域,發(fā)揮其金屬蛋白酶的催化活性,裂解基質(zhì)蛋白、改建組織結(jié)構(gòu),有效調(diào)控細(xì)胞的增殖和分化.ADAM28 AS-ODN通過(guò)參與細(xì)胞凋亡副反饋機(jī)制,并與其它調(diào)控基因、基質(zhì)蛋白等協(xié)同作用,平衡細(xì)胞的增殖、分化和凋亡.<

20、br>　　 第三部分 ADAM28基因?qū)θ搜浪韪杉?xì)胞生物學(xué)功能的影響
　　 目的:探討ADAM28基因?qū)θ搜浪韪杉?xì)胞(HDPSCs)生物學(xué)功能的影響和可能的調(diào)控機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.應(yīng)用酶聯(lián)合消化法(typeⅠcollagenase+dispase)原代培養(yǎng)人牙髓細(xì)胞,間接免疫磁珠法分離純化,經(jīng)免疫熒光染色鑒定HDPSCs的來(lái)源。
　　 2.將ADAM28真核質(zhì)粒、AS-ODN轉(zhuǎn)染HDPSCs

21、48h,經(jīng)免疫熒光、RT-PCR和western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率和各組ADAM28的表達(dá)水平.
　　 3.采用MTT、FCM、酶動(dòng)力學(xué)法、免疫細(xì)胞化學(xué)和western blot檢測(cè)ADAM28真核質(zhì)粒、AS-ODN對(duì)HDPSCs增殖、分化和凋亡的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.成功獲得STRO-1(+)的HDPSCs,證明是來(lái)源于中胚層的間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　 2.ADAM28真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HDPSCs

22、48h后,獲得了具有生物學(xué)活性的ADAM28真核表達(dá)產(chǎn)物,在轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白水平證明ADAM28在HDPSCs內(nèi)能被正確地表達(dá).ADAM28 AS-ODN能顯著促進(jìn)HDPSCs內(nèi)ADAM28 mRNA和蛋白的表達(dá),發(fā)揮明顯的負(fù)向調(diào)控作用。
　　 3.ADAM28真核質(zhì)粒能顯著提高HDPSCs內(nèi)ALP和DSPP的分泌活性,即促進(jìn)HDPSCs多向分化和基質(zhì)礦化,抑制HDPSCs的增殖并誘導(dǎo)其凋亡。ADAM28AS-ODN則顯著促進(jìn)H

23、DPSCs的增殖并抑制其分化。
　　 結(jié)論:ADAM28參與HDPSCs增殖、分化、凋亡的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控,今后可將其獨(dú)特的表達(dá)特性應(yīng)用于基因治療CHTR導(dǎo)致的牙根部牙本質(zhì)發(fā)育缺陷和牙根形態(tài)異常,期望為該病的臨床治療提供新的思路。
　　 本研究應(yīng)用組織工程胚層重組技術(shù),將不同因子組合誘導(dǎo)的大鼠牙源性上皮細(xì)胞+間充質(zhì)細(xì)胞-nHAC/PLA復(fù)合物移植裸鼠體內(nèi),其中TGF-β1+BMP4誘導(dǎo)組形成了牙體組織-骨復(fù)合體樣結(jié)構(gòu),為體內(nèi)牙齒