EPC-BMSC復合細胞膜片的構(gòu)建及其對大鼠牙槽骨缺損修復效果的研究.pdf

1、牙周組織疾病、口腔頜面部外傷、生長發(fā)育畸形和頜面部腫瘤等引起的牙槽骨缺損的治療一直是口腔醫(yī)學研究的難點，備受口腔醫(yī)學學者的關(guān)注。近年來，隨著骨組織工程研究的深入，該方法為牙槽骨缺損的修復和再生開辟了新的思路。由于具有良好的自我增殖和分化潛能，骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）已然成為了應用十分廣泛的種子細胞。然而，組織工程骨的血管化問題以及外源性支架材料的免疫排斥和細胞利用率低等問題，阻礙了骨組織工程的廣泛應用。因此，本實驗擬應用細胞膜片技

2、術(shù)，將血管內(nèi)皮祖細胞（EPCs）與BMSCs直接共培養(yǎng)，經(jīng)成膜誘導后，構(gòu)建出復合細胞膜片，以修復大鼠牙槽骨缺損。希望通過構(gòu)建EPC/BMSC復合細胞膜片，探索有利于BMSCs成骨分化能力的更好的微環(huán)境，以提高BMSCs的骨再生能力，為提供效率更高的干細胞治療牙槽骨缺損修復與再生的方法奠定理論基礎。
　　研究目的：
　　1.分離培養(yǎng)BMSCs及EPCs，構(gòu)建EPC/BMSC復合細胞膜片。
　　2.研究EPC/BMSC復合

3、細胞膜片的成骨能力，探索提高BMSCs成骨能力的微環(huán)境。
　　3.觀察 EPC/BMSC復合細胞膜片修復大鼠牙槽骨缺損的效果，探尋采用復合細胞膜片修復牙槽骨缺損的新方法。
　　研究內(nèi)容與方法：
　　1.分離獲得BMSCs的方法本實驗選擇密度梯度離心法結(jié)合貼壁法，所培養(yǎng)細胞的形態(tài)通過倒置顯微鏡來觀察，細胞表面分子的表達通過流式細胞技術(shù)來檢測，并對細胞進行成骨、成脂方向誘導，檢測多向分化能力。
　　2.采用密度梯度離

4、心法結(jié)合差速貼壁法，在內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基條件下分離并培養(yǎng)EPCs，對培養(yǎng)的細胞進行形態(tài)學上的連續(xù)性觀察，應用流式細胞技術(shù)檢測所培養(yǎng)細胞的表面分子表達情況、并采用雙熒光染色等方法對EPCs進行鑒定。
　　3.將EPCs與BMSCs直接共培養(yǎng)，經(jīng)成膜誘導后，構(gòu)建出EPC/BMSC復合細胞膜片，并對膜片進行HE染色及掃描電鏡觀察。
　　4.將EPCs及BMSCs分別用DiI及DiO熒光染料標記，觀察復合細胞膜片中兩種細胞的分布情況；應

5、用TUNEL法檢測細胞膜片中細胞的凋亡情況。
　　5.對細胞膜片進行ALP及茜素紅染色，并對ALP活性及鈣化結(jié)節(jié)表達情況進行檢測和分析；應用Real-time PCR及Western blot檢測手段對成骨及成血管相關(guān)指標的表達情況進行檢測；ELISA檢測血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達情況。
　　6.建立大鼠牙槽骨缺損模型，將細胞膜片移植入骨缺損區(qū)，對移植術(shù)后的標本進行大體觀察，Micro-CT掃描、BV/TV及TMD相

6、關(guān)檢測，并進行HE及Masson染色，觀察骨缺損修復情況。
　　實驗結(jié)果：
　　1.培養(yǎng)的BMSCs形態(tài)多為紡錘形或多角形，可穩(wěn)定傳代；對于間充質(zhì)干細胞表面標志物，培養(yǎng)的細胞高表達；對于造血干細胞表面標志物，培養(yǎng)的細胞幾乎不表達；培養(yǎng)的細胞具有能夠向成骨、成脂方向分化的能力。
　　2.培養(yǎng)的 EPCs，早期細胞形態(tài)為長梭形，晚期細胞呈現(xiàn)鋪路石樣；細胞雙重表達內(nèi)皮細胞及造血干細胞表面標志物；細胞陽性表達內(nèi)皮細胞特異性分子

7、 vWF；細胞DiI-ac-LDL與FITC-UEA-1雙重熒光染色呈陽性表達。
　　3.將EPCs與BMSCs直接共培養(yǎng)，經(jīng)成膜誘導10天后，可獲得EPC/BMSC復合細胞膜片，膜片呈現(xiàn)半透明膜樣結(jié)構(gòu)，可直接完全從培養(yǎng)皿內(nèi)分離獲得。組織學觀察結(jié)果顯示獲得的細胞膜片具有一定厚度，由多層細胞及細胞外基質(zhì)構(gòu)成。
　　4.隨著直接共培養(yǎng)后成膜誘導時間的延長，EPC/BMSC復合細胞膜片中兩種細胞的胞膜出現(xiàn)某種程度的細胞膜交換現(xiàn)象。

8、此外，與對照組（單一BMSC膜片、單一EPC膜片）相比，復合細胞膜片具有較低的細胞凋亡率。
　　5. EPC/BMSC復合細胞膜片中堿性磷酸酶和鈣化結(jié)節(jié)的表達情況高于對照組（單一BMSC膜片、單一EPC膜片）；復合細胞膜片中成骨及成血管等相關(guān)指標的表達亦高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　6.在不同觀察時間點，EPC/BMSC復合細胞膜片對大鼠牙槽骨缺損的修復能力均強于單一BMSC膜片組與單一EPC膜片組。
　　結(jié)論