雙熒光細胞生物傳感器的構(gòu)建及其在納米材料生物有效性評估中的應(yīng)用.pdf

1、納米材料通常是特征尺寸在1-100 nm的極細材料，容易通過吸入，攝入及皮膚接觸進入生物體內(nèi)。納米材料的種類繁多，在涂料、催化劑、半導(dǎo)體、化妝品、食物添加劑、電子元件和藥物載體等商業(yè)化產(chǎn)品有著廣泛的應(yīng)用。研究表明，隨著人體接觸納米材料的機會增加，納米材料作用于人體會導(dǎo)致一系列的生物學(xué)反應(yīng)。因此，納米材料的生物安全性日益引起人們的關(guān)注。目前，納米毒理學(xué)還沒有建立一套獨立，完善的納米材料毒性評價方法，其主要檢測手段主要是借鑒傳統(tǒng)的環(huán)境有毒物

2、毒理學(xué)評價方法。而納米材料獨特的顆粒效應(yīng)，亟需發(fā)展一種準確、高效、簡便、并適于納米材料毒性評估的檢測方法。本論文首先構(gòu)建了以AP-1、BTG2、IL8啟動子為基礎(chǔ)的雙熒光報告質(zhì)粒（pAP1-MC-EGFP、pBTG2-MC-EGFP及pIL8-MC-EGFP），均以綠色熒光蛋白EGFP和紅色熒光蛋白mCherry為報告基因，組成型啟動子(cytomegalovirus，CMV)控制下游的綠色熒光蛋白EGFP，而誘導(dǎo)型啟動子（AP-1、B

3、TG2或IL8啟動子）控制下游紅色熒光蛋白mCherry表達。組成型表達的EGFP用于監(jiān)測轉(zhuǎn)染效率，而誘導(dǎo)型表達的mCherry熒光信號用于精準反映啟動子的活性。將上述三種雙熒光報告基因質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞，建立相應(yīng)的細胞生物傳感器，用于反映致癌毒性、DNA損傷及炎癥反應(yīng)。通過對細胞生物傳感器的優(yōu)化，成功將其應(yīng)用于納米材料生物毒性效應(yīng)的評估及環(huán)境因子對納米材料生物毒性效應(yīng)的影響，初步探討納米材料暴露下細胞內(nèi)基因表達調(diào)控機制，從而為研

4、究納米材料影響胞內(nèi)特定基因的表達提供重要信息。同時，結(jié)合傳統(tǒng)的生物毒性檢測手段，采用細胞生物傳感器初步探究了納米氧化鈦的細胞毒性和基因毒性。本論文主要研究方結(jié)果如下:
　　1、本論文構(gòu)建了新型的雙熒光報告質(zhì)粒pAP1-MC-EGFP、pBTG2-MC-EGFP、pIL8-MC-EGFP，分別建立傳感器細胞H1299-AP1、H1299-BTG2、H1299-IL8，通過比較細胞類型、培養(yǎng)條件、流式分析策略等對檢測結(jié)果的影響，對該細

5、胞生物傳感器檢測納米材料生物毒性的實驗體系進行了優(yōu)化。在檢測靈敏度和準確性等方面得到顯著提高。同時，與傳統(tǒng)的生物檢測方法（Western Blot、RT-PCR、免疫熒光細胞化學(xué)）得到的實驗結(jié)果相比，細胞生物傳感器檢測結(jié)果與其具有良好的一致性。
　　2、利用流式細胞術(shù)，將細胞生物傳感器成功應(yīng)用于納米材料生物毒性的檢測。結(jié)果顯示，不同種類的納米材料引起的基因轉(zhuǎn)錄活性差異很大。其中，碳族納米材料基本不影響胞內(nèi)AP-1啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，

6、而金屬及金屬氧化物納米材料增高了胞內(nèi)三種啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，且存在濃度依賴性，具有較強的致癌性、DNA損傷、免疫炎癥反應(yīng)等生物毒性。
　　3、金屬及氧化物納米材料在不同的環(huán)境因子（老化、UVA輻照、富里酸）影響下，其細胞毒性也發(fā)生了很大的改變。老化可能增加納米銀和納米氧化鈦的毒性風(fēng)險;FA可能會降低納米銀和納米氧化鈦的生物毒性;UVA輻照對納米材料生物毒性的影響與材料種類有關(guān)。
　　4、結(jié)合傳統(tǒng)的生物毒性檢測方法，細胞生物傳感