肝臟誘導(dǎo)系統(tǒng)性免疫耐受及其逆轉(zhuǎn)研究.pdf

1、肝臟具有獨(dú)特的誘導(dǎo)免疫耐受的功能，持續(xù)性表達(dá)或遞呈于肝臟中的抗原物質(zhì)通常會(huì)誘發(fā)針對(duì)該抗原的系統(tǒng)性免疫耐受而非免疫應(yīng)答，諸如肝臟移植，慢性嗜肝病毒感染，口服耐受等。肝臟誘導(dǎo)耐受的特性與其生理結(jié)構(gòu)，細(xì)胞組成等密切相關(guān)，例如肝臟的門(mén)靜脈供血使其持續(xù)受刺激于腸道來(lái)源的共生菌及食物代謝產(chǎn)物;肝竇內(nèi)血液儲(chǔ)量豐富，血流極其緩慢;肝臟免疫細(xì)胞組成呈天然免疫優(yōu)勢(shì)狀態(tài)且分布有多種致耐受的抗原遞呈細(xì)胞。這些特征為肝臟誘導(dǎo)免疫耐受提供了時(shí)間與空間基礎(chǔ)，從而通過(guò)

2、誘導(dǎo)免疫抑制細(xì)胞、免疫偏離、T細(xì)胞無(wú)能以及克隆清除等各種機(jī)制實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)性的抗原特異性免疫耐受。
　　操縱肝臟的免疫耐受功能具有廣闊的臨床轉(zhuǎn)化前景，例如肝臟移植可以使得后續(xù)的皮膚、腎臟等各器官移植排斥顯著降低;肝臟過(guò)表達(dá)自身抗原可以有效抑制自身免疫病的發(fā)生;靶向肝臟的基因表達(dá)還可以避免免疫應(yīng)答，從而極大改善基因治療效果。而當(dāng)嗜肝微生物，如乙肝、丙肝病毒感染時(shí)，病毒抗原持續(xù)表達(dá)于肝臟中同樣會(huì)導(dǎo)致系統(tǒng)性免疫耐受，使得機(jī)體不能產(chǎn)生有效的抗病

3、毒免疫應(yīng)答，從而形成慢性感染，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康。由此可知，研究肝臟的免疫耐受機(jī)制，尋找免疫耐受維持與逆轉(zhuǎn)的分子靶點(diǎn)，對(duì)于治療包括自身免疫病，感染性疾病在內(nèi)的一系列重大疾病具有十分重要的意義。
　　本項(xiàng)研究旨在利用小鼠肝臟持續(xù)攜帶HBV所誘導(dǎo)的系統(tǒng)性耐受模型，研究肝臟誘導(dǎo)系統(tǒng)性免疫耐受的機(jī)制及逆轉(zhuǎn)方法，具體工作分為兩大部分:
　?、?基于白細(xì)胞介素12的疫苗療法有效逆轉(zhuǎn)HBV誘導(dǎo)的系統(tǒng)性免疫耐受
　　1.HBV攜帶小鼠模

4、擬肝臟病毒慢性感染誘導(dǎo)的系統(tǒng)性免疫耐受狀態(tài)
　　通過(guò)對(duì)小鼠尾靜脈高壓注射HBV質(zhì)粒，可以成功實(shí)現(xiàn)HBV在小鼠肝細(xì)胞內(nèi)復(fù)制表達(dá)，其中30％小鼠能長(zhǎng)期攜帶表達(dá)HBV，且表現(xiàn)出無(wú)肝損傷，對(duì)外周HBV疫苗無(wú)應(yīng)答的耐受狀態(tài)，從而很好模擬了HBV慢性感染人群中的無(wú)癥狀攜帶者。
　　2.基于白介素12的疫苗療法能有效清除HBV病毒
　　白介素12預(yù)處理以及同HBV疫苗共注射的治療方式，我們稱(chēng)之為基于白介素12的疫苗療法，可以有效清除

5、HBV攜帶小鼠體內(nèi)HBV病毒，導(dǎo)致HBsAg、HBeAg、 HBV DNA以及HBcAg顯著降低，且不會(huì)造成肝損傷，是一種安全有效的潛在治療方法。
　　3.基于白介素12的疫苗療法有效逆轉(zhuǎn)HBV誘導(dǎo)的系統(tǒng)性免疫耐受
　　白介素12聯(lián)合疫苗治療可以激起HBV攜帶小鼠體內(nèi)HBV特異性記憶應(yīng)答，誘發(fā)濾泡樣T輔助細(xì)胞和生發(fā)中心B細(xì)胞擴(kuò)增，anti-HBs抗體生成，T細(xì)胞特異性增殖等一系列HBV特異性應(yīng)答，證實(shí)HBV誘導(dǎo)的系統(tǒng)性免疫耐

6、受被逆轉(zhuǎn)。
　　4.基于白介素12的疫苗療法協(xié)同有效刺激HBV特異性T細(xì)胞應(yīng)答
　　白介素12聯(lián)合疫苗治療主要通過(guò)適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，尤其是T細(xì)胞來(lái)發(fā)揮功能，可以顯著增強(qiáng)抗原特異性CD4+T和CD8+T擴(kuò)增，活化及效應(yīng)功能發(fā)揮，并抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞生成。
　　結(jié)論Ⅰ:我們發(fā)現(xiàn)基于白介素12的疫苗療法可以逆轉(zhuǎn)HBV誘導(dǎo)系統(tǒng)性免疫耐受，激發(fā)強(qiáng)烈且多抗原反應(yīng)性的anti-HBVT細(xì)胞應(yīng)答，且抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞生成，進(jìn)而有效促進(jìn)HBV

7、攜帶小鼠清除HBV。
　?、?干擾素γ通過(guò)促進(jìn)T細(xì)胞肝臟滯留而維持肝臟誘導(dǎo)的系統(tǒng)性免疫耐受
　　1.干擾素γ（IFN-γ）缺失導(dǎo)致系統(tǒng)性免疫耐受消失
　　野生小鼠持續(xù)攜帶HBV時(shí)會(huì)導(dǎo)致形成系統(tǒng)性HBV免疫耐受，而在IFN-γ缺失(GKO)小鼠當(dāng)中，盡管相較野生小鼠更容易持續(xù)攜帶HBV，HBV誘導(dǎo)的系統(tǒng)性耐受卻不復(fù)存在，導(dǎo)致此小鼠在外周HBV疫苗免疫時(shí)發(fā)生顯著應(yīng)答，如HBsAg，HBeAg降低，anti-HBs出現(xiàn)，生發(fā)

8、中心B細(xì)胞擴(kuò)增，T細(xì)胞恢復(fù)特異性增殖等。
　　2.CD4+T細(xì)胞來(lái)源IFN-γ維持系統(tǒng)性免疫耐受
　　我們發(fā)現(xiàn)相較于對(duì)照小鼠，HBV攜帶小鼠肝臟CD4+T淋巴細(xì)胞在CD3和CD28抗體聯(lián)合刺激時(shí)，產(chǎn)生IFN-γ水平顯著增高。而通過(guò)轉(zhuǎn)輸重建實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)用IFN-γ缺陷的CD4+T細(xì)胞重建的CD4-/-小鼠誘導(dǎo)HBV耐受能力消失，同IFN-γ缺陷相類(lèi)似。因而證明HBV攜帶過(guò)程中，主要由CD4+T細(xì)胞來(lái)源IFN-γ維持系統(tǒng)性免疫

9、耐受。
　　3.IFN-γ通過(guò)CXCL9介導(dǎo)的肝臟CD4+T滯留來(lái)維持耐受
　　我們發(fā)現(xiàn)肝臟CXCL9水平在IFN-γ受體缺陷型HBV小鼠中表達(dá)顯著低于野生HBV小鼠;與之相一致的是，IFN-γ受體缺陷型HBV小鼠肝臟滯留HBV- primed CD4+T細(xì)胞能力也顯著低于野生HBV小鼠。而通過(guò)對(duì)IFN-γ受體缺陷型HBV小鼠肝臟回復(fù)表達(dá)CXCL9可以恢復(fù)其滯留T細(xì)胞的能力，并部分恢復(fù)HBV誘導(dǎo)的系統(tǒng)性免疫耐受。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)

10、現(xiàn)，在野生型HBV小鼠中預(yù)先阻斷CXCL9的受體CXCR3可以部分逆轉(zhuǎn)HBV誘導(dǎo)的系統(tǒng)性耐受。
　　4.肝臟駐留巨噬細(xì)胞通過(guò)調(diào)控T細(xì)胞滯留參與耐受形成
　　通過(guò)比較HBV與對(duì)照小鼠肝臟中不同細(xì)胞分泌CXCL9的水平，我們發(fā)現(xiàn)肝臟駐留巨噬細(xì)胞，即Kupffer細(xì)胞是HBV持續(xù)攜帶時(shí)肝內(nèi)CXCL9的主要來(lái)源。利用脂質(zhì)體清除Kupffer細(xì)胞可以顯著降低肝內(nèi)CXCL9水平，阻礙HBV-primed CD4+T細(xì)胞滯留，并打破HBV