類球紅細菌產(chǎn)輔酶Q10的菌種丟棄及發(fā)酵條件優(yōu)化.pdf

1、輔酶Q10(Coenzyme Q10，簡寫為CoQ10)，又稱泛醌(Ubiquinone)，化學名稱為2，3-二甲氧基-5-甲基-6-癸異戊烯基-1，4-苯醌。CoQ10在細胞呼吸鏈上位于NADH和細胞色素C之間，起傳遞氫質(zhì)子的作用，是人體中唯一的輔酶Q類物質(zhì)。其在各種動植物細胞和細菌中廣泛存在，具有抗氧化、抗衰老、清除體內(nèi)自由基、提高機體免疫力等功能。已經(jīng)被越來越多的應(yīng)用于各類心臟病、急慢性肝炎、帕金森癥等疾病的輔助治療，并在保健品及

2、化妝品領(lǐng)域具有廣闊的市場。
　　 微生物發(fā)酵法是目前生產(chǎn)CoQ10的主要生產(chǎn)方法之一，優(yōu)良的發(fā)酵菌株是微生物發(fā)酵法工業(yè)化生產(chǎn)CoQ10的前提，而通過發(fā)酵條件的優(yōu)化，進而使菌株最大程度的發(fā)揮其發(fā)酵能力，是工業(yè)生產(chǎn)最經(jīng)常使用的調(diào)控方式之一。
　　 由于CoQ10的生物合成途徑復(fù)雜，涉及超過20種代謝中間產(chǎn)物及調(diào)控酶類，現(xiàn)階段通過基因工程方法改變單一或某幾個關(guān)鍵酶基因?qū)Πl(fā)酵菌株的生產(chǎn)能力提高有限。傳統(tǒng)物理和化學誘變育種技術(shù)仍是

3、CoQ10生產(chǎn)育種的重要手段。
　　 本論文采用鈷60(Co60)輻照誘變方法結(jié)合傳統(tǒng)紫外線誘變育種方法對實驗室現(xiàn)有菌株進行誘變育種，并利用實驗室建立的高通量篩選平臺進行篩選，從中篩選出產(chǎn)量較高的突變株作為種源。調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基中不同碳氮比并根據(jù)CoQ10生物合成和代謝途徑選擇不同前體物質(zhì)，正交試驗確定前體物質(zhì)的最優(yōu)發(fā)酵配比，利用發(fā)酵罐在線檢測篩選菌株的生長狀態(tài)，以不同時間點CoQ10的產(chǎn)量為指標對優(yōu)化條件進行驗證。本論文共分三個

4、部分：(1)類球紅細菌菌株的誘變育種研究；(2)類球紅細菌生產(chǎn)CoQ10的發(fā)酵條件優(yōu)化；(3)CoQ10的發(fā)酵罐中試規(guī)模試驗。主要研究結(jié)果如下：
　　 通過C060和紫外線誘變實驗篩選出較初始菌株類球紅細菌Rhodobacer.sphaeroides高產(chǎn)的突變株6株；篩選確定適合的發(fā)酵培養(yǎng)基碳源比例；最優(yōu)發(fā)酵前體組合；發(fā)酵罐中試放大驗證優(yōu)化條件有效。
　　 一、誘變育種試驗
　　 根據(jù)文獻調(diào)研確定Co60誘變輻照

5、強度為5Gy，致死率達到95％以上，符合誘變要求；利用實驗室建立的高通量篩選平臺將選出的菌株繼續(xù)紫外線誘變，最終篩選出較高產(chǎn)量的突變株6株。
　　 二、類球紅細菌產(chǎn)CoQ10發(fā)酵條件優(yōu)化
　　 調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基碳源比例，以CoQ10產(chǎn)量為指標最終確定碳源含量。試驗了對羥基苯甲酸、維生素B1，乙酸鈉、西紅柿汁、胡蘿卜汁、異戊醇等參與輔酶Q10合成代謝的多種發(fā)酵前體，最終正交試驗確定發(fā)酵前體的最優(yōu)配比為VB110mg/L、乙酸

6、鈉100 mg/L、對羥基苯甲酸20 mg/L、花生油0.01％。在此條件下CoQ10產(chǎn)量由13.296 mg/L增加到31.824 mg/L，產(chǎn)量提高了139％。
　　 三、發(fā)酵罐優(yōu)化條件驗證實驗
　　 利用篩選出的發(fā)酵培養(yǎng)基碳氮比例為基礎(chǔ)培養(yǎng)條件，pH、溶氧為在線觀測指標，不同時間點取樣，通過斐林試劑法檢測發(fā)酵液中總糖含量，確定碳源的動態(tài)消耗；考察發(fā)酵前體添加與否、添加時機對CoQ10產(chǎn)量的影響；研究不同溶氧條件下突